硫酸锌对缺氧/复氧损伤H9c2心肌细胞自噬及氧化应激的影响

吴小燕，吴曾繁，陈 磊

经皮冠状动脉介入术是治疗缺血性心脏病的有效方法，然而缺血心肌复氧后的缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤常常会减弱治疗效果甚至加重心肌损伤[1]。诱发I/R损伤的机制较为复杂，心肌细胞凋亡是其中的重要病理机制[2]，自噬是机体的一种防御和应激调控反应，适当的自噬可以修复受损的细胞器，维持细胞内稳态，I/R损伤中适当激活的自噬可以起到拮抗心肌细胞凋亡的作用[3]。锌是重要的细胞内信号传导分子[4]，研究发现，补充外源性锌可减轻心肌I/R损伤，但其机制尚未明确[5]。本研究使用H9c2心肌细胞进行缺氧/复氧(hypoxia and reoxygenation，H/R)实验，模拟心肌I/R损伤，探讨硫酸锌对H/R心肌细胞自噬的影响，以及心肌H/R损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 心肌H9c2细胞株购自上海子实生物科技有限公司，硫酸锌购自美国Sigma 公司，无糖DMEM培养基、低糖DMEM培养基购于美国 Gibco 公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购于四季青公司，Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技有限公司，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，自噬体膜型(LC3Ⅱ)抗体和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)内参抗体购自美国Cell Signaling公司，辣根过氧化物酶标记的二抗购于上海康成生物工程有限公司，RIPA蛋白裂解液、0.25%胰蛋白酶购自北京碧云天生物科技有限公司，二氧化碳(CO2)细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司，流式细胞仪购自美国BD公司。

1.2 实验分组和H/R模型构建 实验分为对照组、H/R组、低剂量硫酸锌组(LD-Zn组)和高剂量硫酸锌组(HD-Zn组)。对照组H9c2细胞培养于10% FBS的低糖DMEM培养基中，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中，80%细胞融合时，0.25%胰蛋白酶消化细胞传代。H/R组H9c2细胞培养于无血清、无糖DMEM培养基中，置于37 ℃、1%O2细胞培养箱中缺氧培养24 h。LD-Zn组H9c2细胞缺氧培养24 h后，加入10 μmol/L硫酸锌后，换10% FBS的低糖DMEM培养基，置于37 ℃、21%O2细胞培养箱中进行复氧处理4 h，进行后续实验。HD-Zn组H9c2细胞缺氧培养24 h后，加入20 μmol/L硫酸锌后，换10% FBS的低糖DMEM培养基，置于37 ℃、21%O2细胞培养箱中进行复氧处理4 h。

1.3 细胞凋亡检测 0.25%胰蛋白酶消化对照组、H/R组、LD-Zn组和HD-Zn组H9c2细胞，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞2次，按照Annexin V/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，加入Annexin V(1∶20)室温孵育3 min，再加入20 μg/mL PI室温孵育15 min，进行流式细胞仪测定，仪器自带BD Cell QuestTMPro软件收集凋亡细胞(Annexin V阳性或Annexin V和PI双阳性的细胞)，计算凋亡细胞比例。

1.4 SOD和MDA表达的检测 收集对照组、H/R组、LD-Zn组和HD-Zn组H9c2细胞，使用黄嘌呤氧化酶法检测SOD，硫代巴比妥酸比色法检测 MDA，严格按照试剂盒说明书操作，加入相关试剂裂解细胞完成检测。

1.5 蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌H9c2细胞蛋白表达 收集对照组、H/R组、LD-Zn组和HD-Zn组H9c2细胞，加入RIPA蛋白裂解液，95 ℃水浴裂解液20 min后，将蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，转印至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，按照抗体说明书加入LC3Ⅱ抗体(1∶1 000)或者GAPDH内参抗体(1∶5 000)4 ℃孵育过夜，加入二抗室温孵育2 h，X-ray曝光显影，凝胶成像系统采集图像，Image J软件对照内参分析LC3Ⅱ蛋白条带的灰度值。

2 结 果

2.1 各组H9c2心肌细胞凋亡率比较 对照组、H/R组、LD-Zn组和HD-Zn组H9c2心肌细胞凋亡率比较差异有统计学意义(F=18.416，P<0.01)。其中H/R组H9c2心肌细胞凋亡率高于对照组(P<0.01)，LD-Zn组和HD-Zn组H9c2细胞凋亡率明显低于H/R组(P<0.01)，HD-Zn组H9c2细胞凋亡率明显低于LD-Zn组(P<0.01)。详见图1、表1。

图1 流式细胞仪检测各组H9c2心肌细胞凋亡率

表1 各组H9c2心肌细胞凋亡率比较 单位：%

2.2 各组H/R心肌细胞MDA和SOD表达比较 对照组、H/R组、LD-Zn组、HD-Zn组H9c2心肌细胞MDA和SOD水平比较差异有统计学意义(P<0.01)。其中H/R组MDA水平明显高于对照组(P<0.01)，LD-Zn组和HD-Zn组MDA水平明显低于H/R组(P<0.01)，HD-Zn组MDA水平明显低于LD-Zn组(P<0.01)；H/R组SOD水平明显低于对照组(P<0.01)，LD-Zn组和HD-Zn组SOD水平明显高于H/R组(P<0.01)，HD-Zn组SOD水平明显高于LD-Zn组(P<0.01)。详见表2。

表2 4组MDA、SOD水平比较

2.3 各组H/R心肌细胞LC3Ⅱ蛋白表达比较 对照组、H/R组、LD-Zn组和HD-Zn组H9c2心肌细胞自噬蛋白LC3Ⅱ表达比较差异有统计学意义(F=13.542，P<0.01)。LD-Zn组和HD-Zn组LC3Ⅱ蛋白相对灰度值明显高于H/R组(P<0.01)，HD-Zn组LC3Ⅱ蛋白相对灰度值明显高于LD-Zn组(P<0.01)。详见图2及表3。

图2 Western Blot检测LC3Ⅱ蛋白表达

表3 各组LC3Ⅱ蛋白表达比较

3 讨 论

近年来，心肌梗死发病率日益提高，随着经皮冠状动脉扩张、支架植入术的广泛使用，极大地提高了心肌梗死的救治率，但缺血心肌再灌注后心肌细胞的H/R损伤依然给临床工作带来了新的问题与挑战[6]。研究已证实锌离子在心力衰竭、血栓形成中对心肌细胞及内皮细胞具有保护作用[7]，周蔷等[8]研究发现，硫酸锌有利于心肌梗死大鼠心功能的恢复；付海荣[9]研究发现硫酸锌可以抑制大鼠急性梗死心肌细胞的凋亡。本研究结果显示，LD-Zn组和HD-Zn组细胞凋亡率明显低于H/R组，说明硫酸锌可以抑制H/R损伤导致的心肌细胞凋亡。H/R损伤时氧化应激激活，活性氧(ROS)大量积累，诱导心肌细胞凋亡[10]。SOD是一种抗氧化酶，MDA是氧化应激反应的代谢产物，MDA和SOD是监控氧化应激的常用指标。本研究结果显示，LD-Zn组和HD-Zn组MDA明显低于H/R组，SOD明显高于H/R组，说明硫酸锌可以抑制H/R损伤激发的氧化应激反应。硫酸锌抗H/R损伤导致的心肌细胞凋亡可能与抑制氧化应激反应相关。

心肌细胞对能量的需求量非常大，故而心肌细胞含有大量线粒体保证其能量供应，氧化应激时，线粒体损伤更容易损伤心肌细胞，自噬可以增强清除受损的线粒体和内质网，给细胞提供能量，保持细胞稳态[11]，通过调控自噬可以减轻氧化应激导致的大鼠心肌缺血再灌注损伤[12-13]。LC3Ⅱ是一个自噬标志蛋白，在自噬增强时LC3Ⅱ表达增多[14]，本研究显示，LD-Zn组和HD-Zn组LC3Ⅱ蛋白相对灰度值明显高于H/R组，说明硫酸锌可明显增加H/R损伤心肌细胞的自噬反应。

综上所述，硫酸锌可以增强H/R损伤心肌细胞的自噬，抑制氧化应激损伤和心肌细胞凋亡。