复方中草药对兔乳房炎的预防作用及其机制探讨

韩 昱，张 宁，胡晓悦，肖文同，张立永，张富梅*

(1.河北北方学院实验动物中心，河北 张家口 075000；2.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000；3.唐山市动物卫生监督所，河北 唐山 063000；4.河北北方学院动物科技学院，河北 张家口 075000)

【研究意义】兔产业是畜牧业的重要组成部分，但在养殖过程中，母兔泌乳能力差严重制约了养兔业的发展，而乳房炎是导致母兔泌乳能力下降的主要疾病。随着无抗养殖的实施和人民生活水平的不断提升，养兔业面临绿色、健康等新的挑战。因此，探讨中草药防治乳房炎是促进兔业生态健康发展的重要措施。【前人研究进展】母兔乳房炎是母兔泌乳期最主要的疾病。肖文渊等[1]调查统计了西昌市的大量繁殖母兔，发现母兔淘汰率较高，有12.29 %的母兔患有乳房炎，仔兔断奶后成活率较低。在防治乳房炎的用药上，传统方法是使用抗生素。而滥用抗生素会致使细菌耐药性及药物残留的产生，耐药菌株和残留的抗生素通过食物链转移给人类，对人类的健康造成危害。中草药具有无抗药性、无残留、加工简便，成本低廉等特点，而且在抗炎，增强机体免疫力等方面具有重要作用[2-3]。到目前为止，关于中草药防治兔乳房炎及其机制的研究鲜见报道，尚未引起业界足够重视。【本研究切入点】本研究利用前期筛选确定的具有疏肝解郁、疏经通络、活血下乳、清热解毒、活血散瘀的复方中草药[4]，进一步研究其在预防母兔乳房炎中的作用，并对其作用机制进行探讨。【拟解决的关键问题】本研究结果以期为广泛推广应用提供理论依据和实践指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

试验用塞北兔由张家口某养殖场提供。母兔40只，年龄相同(12月龄左右)，胎次(2～3胎)、产奶量接近，窝产活仔数5～9只；健康公兔6只。中草药购自河北北方学院校医院。复方中草药主要成分为党参、炒白术、柴胡、金银花、王不留行、通草、蒲公英等。将中草药按照组方用超微粉碎机粉碎，均匀混合于饲粮中。

1.2 试验设计

将选择的试验母兔40只随机分为2组，即对照组和试验组，每组20只。对照组饲喂基础饲粮，试验组于产前15 d至产后15 d饲喂添加1.5 %复方中草药的饲粮，其它时间饲喂基础饲粮。试验期从产前15 d至仔兔30 d断奶，共45 d。在试验期间，不改变兔原来的基础饲粮配方、饲喂量、饲喂次数及时间，饲养环境及管理方法也不作改善和调整。按常规管理方法做好驱虫、免疫、消毒工作。

1.3 检测指标

1.3.1 母兔乳房炎发病率统计 连续统计对照组和试验组中每只母兔各4窝次母兔乳房炎的发病数及淘汰母兔数，计算乳房炎发病率和母兔淘汰率。

1.3.2 母兔血液免疫指标的测定 于母兔产后4、10、20 d，分别从对照组和试验组随机选取10只母兔，采集血液，每次采血固定在上午8：00-10：00进行。每只兔无菌耳静脉采血2份，1份不用抗凝剂(2 mL)，制备血清，分装于1.5 mL离心管中，-80 ℃保存，用于血清中免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、白细胞介素-2(IL-2)和白细胞介素-6(IL-6)含量的测定；另外1份用肝素钠作为抗凝剂(2 mL)，用于分离淋巴细胞，测定T淋巴细胞百分率。①母兔血清中IgG、IgM、IL-2和IL-6含量的测定。血清样品送河北博海生物工程开发有限公司，IgG、IgM、IL-2和IL-6含量均采用生物素双抗体夹心ELISA方法进行测定。②T淋巴细胞百分率的测定。应用α-醋酸萘酯酶法(ANAE法)测定母兔血液中T淋巴细胞数，计算T淋巴细胞百分率。

1.3.3 母兔初乳IgG含量测定 从对照组和试验组分别随机选择10只母兔，于分娩后24～48 h采集初乳，分置于1.5 mL离心管中，-80 ℃保存。样品送北京华英生物技术研究所，测定初乳中IgG含量(比色法)。

1.3.4 仔兔血清IgG及血清蛋白含量的测定 分别于产后5～6 d随机从每组选择10只母兔，在每只母兔所产仔兔中选择接近平均体重的仔兔，无菌采集仔兔血液，制备血清，分装于1.5 mL离心管中，-80 ℃保存。样品送北京华英生物技术研究所，采用比色法测定血清IgG以及总蛋白(TP)和白蛋白(ALB)含量，并计算血清球蛋白(GLB)含量。

GLB含量=TP含量-ALB含量

1.4 数据的统计

分析采用 SPSS19.0 软件对试验数据进行单因素方差分析，结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 复方中草药对母兔乳房炎发病率的影响

由表1显示，在繁殖窝次相同的条件下，对照组乳房炎发病率为12.5 %，母兔淘汰率为15 %。饲喂复方中草药后，试验组发病率降低到3.75 %，较对照组降低了8.75 %，母兔淘汰率降低到5 %，降低了10 %。说明本试验所用复方中草药可以明显降低母兔乳房炎发病率，减少淘汰率。

表1 乳房炎发病率和母兔淘汰率统计Table 1 Statistics on incidence of mastitis and elimination rate of female rabbits

2.2 复方中草药对母兔血液免疫指标的影响

2.2.1 复方中草药对母兔血清中IgG、IgM及细胞因子IL-2和IL-6含量的影响 由表2表明，与对照组相比，分娩后4d试验组血清中IgG、IL-2及IL-6含量均有一定的增加，但差异不显著(P>0.05)，IgM含量显著提高(P<0.05)；分娩后10 d试验组血清中IgG含量显著升高(P<0.05)，IgM、IL-2及IL-6含量极显著增加(P<0.01)；分娩后20 d试验组血清中IgG、IgM含量显著升高(P<0.05)，IL-2含量极显著增加(P<0.01)，IL-6含量有升高趋势，但差异不显著(P>0.05)。由此提示，所用复方中草药能够有效提高母兔血清中的免疫指标水平，对母兔的免疫机能具有显著的增强作用。

表2 母兔血清中IgG、IgM、IL-2和IL-6含量测定Table 2 Results of determination of IgG,IgM,IL-2 and IL-6 in the serum of female rabbits

2.2.2 复方中草药对母兔血液T淋巴细胞百分率的影响 由表3显示，与对照组相比，分娩后4 和10 d，试验组血液中T淋巴细胞百分率均呈现显著增加(P<0.05)，分娩后20 d T淋巴细胞百分率具有升高趋势，但差异不显著(P>0.05)。该项结果表明，复方中草药能够有效提升母兔的细胞免疫水平，进而也可促进机体免疫性能的提高。

表3 母兔血液T淋巴细胞百分率测定Table 3 Results of determination of blood T lymphocyte percentage in female rabbits

2.3 复方中草药对母兔初乳IgG含量的影响

由表4显示，试验组母兔初乳中IgG含量较对照组显著提高，提高了6.45个百分点(P<0.05)。由此可见，饲粮中添加复方中草药可以显著提高母兔初乳中IgG含量，从而对增强初生仔兔的被动免疫发挥了重要作用。

表4 母兔初乳IgG含量测定结果Table 4 Result of determination of IgG content in female colostrum

2.4 复方中草药对初生仔兔血清IgG及血清蛋白含量的影响

由表5显示，试验组初生仔兔血清中IgG水平明显升高，较对照组差异显著(P<0.05)；TP、GLB含量显著增加(P<0.05)，ALB含量也有所提高，但差异不显著(P>0.05)。结果表明，分娩前后母兔饲粮中添加复方中草药可以有效提高初生仔兔免疫水平，有助于促进其健康生长。

表5 仔兔血清IgG及血清蛋白含量的测定Table 5 Determination of serum IgG and serum protein in young rabbits

3 讨 论

3.1 复方中草药对母兔乳房炎的预防作用

传统方法中，防治兔乳房炎普遍采用抗生素[5-6]。

成栓之[7]研究发现，复方环丙沙星等能够有效治疗母兔乳房炎。但另有研究发现，在预防兔乳房炎上，磺胺嘧啶西药配方效果不佳，可能菌株对该药品产生耐药性所致[1]。抗生素滥用导致的药物残留和病原菌耐药性增强等问题亟待解决。因此，在生态健康养殖大环境下，应用中草药防治兔乳房炎是发展趋势。

目前，关于中草药对动物乳房炎的影响研究，主要集中在牛乳房炎的防治上，并取得了较好成效。沃野千里等[8]研究发现，应用黄芪多糖替代抗生素来预防和控制奶牛乳房炎有较好的前景；凌丁等[9]对奶牛饲喂黄芪、党参等中草药添加剂，发现能够防治奶牛隐性乳房炎，可有效降低隐性乳房炎的发病率，提高产奶量；另外，有学者在植物提取物对奶牛乳房炎的作用及其机制方面进行了综述，认为其能够作为部分抗生素的替代物，成为奶牛乳房炎的新型防治手段[10-11]。有关中草药预防母兔乳房炎，我国学者也进行了初步探索，但缺乏系统深入的研究。肖文渊等[1]利用蒲公英复方进行齐卡白兔母兔乳房炎预防试验，结果发现其能够有效预防乳房炎，发病率由12.82 %降为5.13 %，母兔淘汰率由15.38 %降为7.69 %。本试验在分娩前后母兔的饲粮中添加复方中草药，结果发现，母兔乳房炎发病率降低为3.75 %，较对照组降低了8.75个百分点，母兔淘汰率试验组仅为5 %，而对照组达到15 %。由此可见所用复方中草药对预防母兔乳房炎具有明显作用，这与上述肖文渊以及中草药预防牛乳房炎的研究结论一致。同时，课题组前期试验发现，该复方中草药可以显著提高母兔泌乳力，改善乳成分，提高断奶仔兔成活率且促进仔兔生长[4]，本试验为上述结论提供了进一步的佐证。

3.2 复方中草药预防母兔乳房炎作用机制探讨

关于中草药预防乳房炎的作用机制，国内学者开展了一些研究，主要集中在如何提高机体免疫性能方面[2-3]。反应机体免疫性能的指标除了参与非特异性免疫的吞噬细胞外，主要还有免疫球蛋白以及一些细胞因子等。免疫球蛋白Ig在机体内发挥着特异性免疫作用，其中IgG可以调理、凝聚和沉淀抗原，发挥抗菌、抗病毒、抗毒素等免疫学活性，因而在机体免疫保护中发挥关键作用；IgM在机体对感染的免疫应答过程中较先发挥作用，具有较强的杀菌、溶菌、促吞噬、中和毒素和抗病毒等免疫活性[12]；T淋巴细胞作为重要的免疫细胞，若出现免疫缺陷或低活性，机体免疫功能会降低[13]；IL-2和IL-6均是细胞因子。IL-2具有广泛的生物学活性，最显著的作用是影响T淋巴细胞的生长，并可促进活化B细胞增殖，使抗体分泌增多，故为调控免疫应答的重要因子，IL-6能够刺激参与免疫反应的细胞增生、分化，并提高其功能[14-15]。

目前，关于中草药防治兔乳房炎的作用机制，尚缺乏深入的探究，限制了中草药防治兔乳房炎的推广应用。本试验在这方面开展了研究。选用的复方中草药主要由蒲公英、金银花、党参、柴胡、王不留行、通草等组成。蒲公英和金银花具有清热解毒、活血散瘀、消除炎症的作用。易琼等[16]研究发现，治疗奶牛隐性乳房炎的复方中草药(蒲公英、金银花、连翘等)提取液可使小鼠的脾脏指数、胸腺指数以及外周血中性粒细胞吞噬金黄色葡萄球菌、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率和吞噬指数较对照组显著提高；周秀萍等[17]发现，服用金银花后能显著提高大鼠巨噬细胞吞噬率及吞噬指数，使机体的淋巴细胞转化率增加，同时强化Th1细胞分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ，提示金银花对机体的免疫功能具有提升作用；党参具有补中益气、生津之功效，柴胡具有疏肝解郁、理气泻火的作用。近年来许多医学研究人员发现运用柴胡皂苷能够在体液以及细胞免疫反应中发挥巨噬细胞以及淋巴细胞功能的调整，并且可以借助激活机体巨噬细胞的方式来活跃其体内的免疫淋巴细胞功能，从而取得反应时免疫激活的效果[18]。通草、王不留行主要具有活血通络、消肿下乳的作用。有学者报道王不留行具有活血通经、消肿、催乳等功效，从而减少乳房炎的发生，提高奶牛泌乳机能、产奶量和乳品质[19]。本试验在母兔分娩前后15 d日粮中添加了复方中草药，测定了分娩后母兔4、10、20 d血液中相关免疫指标，结果发现，所用复方中草药可以明显提高分娩后母兔血清中IgG、IgM以及细胞因子IL-2、IL-6的含量，使母兔血液中T淋巴细胞百分率增加，即可增强和调节母兔的免疫机能，表现出与上述文献报道相一致的结论。所选用复方中草药整体具有疏肝解郁、疏经通络、活血下乳、清热解毒、活血散瘀的功效，可以提高母兔的免疫力和抗病能力，从而降低了乳房炎发生率和淘汰率，这充分显示出所用复方中草药能有效预防母兔乳房炎的重要机制之一就是增强机体抵抗力。

众所周知，初乳对于初生动物获得被动免疫非常重要。由于许多母畜的抗体不能通过胎盘传递给胎儿，所以在胎儿阶段以及刚出生的幼畜血液中，一般都不含兔疫球蛋白或其含量很低，因此幼畜易感染多种病原微生物。幼畜得不到足够的母源抗体往往是造成其患病或死亡的重要原因。IgG作为初乳中主要的免疫球蛋白，具有溶解有害菌、活化补体等作用，能够对胎儿传导免疫力，从而提升其抗感染能力[14]。有研究发现，对出生12 h内犊牛饲喂初乳，其结肠中与粘膜和消化道相关的总细菌的丰度更高，病原性大肠杆菌和大肠杆菌-志贺氏菌属减少[20]；另有报道称，母源抗体水平是被动免疫和防止犊牛腹泻的重要因素，通过初乳被动获得的抗体能够使犊牛免受腹泻的侵害[21]。本试验结果显示，分娩前后母兔饲粮中添加复方中草药可以明显提高初乳中IgG含量，而且测定产后5～6 d仔兔血清中IgG及总蛋白和球蛋白含量显示，均较对照组显著提高。这说明仔兔通过初乳抗病能力得到相应提高，这也是前期试验中所用复方中草药提高断奶仔兔成活率，进而促进仔兔健康生长的又一个重要原因[4]。

4 结 论

分娩前后母兔饲粮中添加适量复方中草药，可以有效降低乳房炎发病率和母兔淘汰率，其作用机制是应用复方中草药能显著提高分娩后母兔免疫球蛋白IgG、IgM和细胞因子IL-2、IL-6的水平，以及T淋巴细胞百分率，进而增强了母兔免疫能力，提高抗病能力；母兔饲粮中添加复方中草药，可以显著提高初乳中IgG含量，使仔兔免疫力和抗病力增强，有利于促进仔兔健康生长。本研究为促进所选复方中草药的广泛推广应用提供了充分的理论依据，为促进养兔业生态健康发展探索出有效路径。