林麝FSHβ、LHβ基因多态位点与产香性能关联分析

杜欣颖，王 笳，王建明，周 磊，郑程莉*

(1.四川省中医药科学院，四川 成都 610200；2.四川养麝研究所，四川 成都 610200)

【研究意义】麝香是中国名贵中药，为雄性麝类动物香囊分泌的产物，其产量受激素调控影响。FSHβ和LHβ基因在林麝泌香过程中发挥重要作用，然而它们与泌香的关联分析鲜有报道。本文采用DNA混池测序技术对FSHβ和LHβ基因多态性位点进行检测，并将突变位点位点与麝香产量进行关联分析，以期从遗传水平上揭示林麝产香性能机理。【前人研究进展】麝香(Moschus)是传统中药的重要成分，具有开窍醒神，活血通经，消肿止痛的功效[1]。麝香主要由我国一级重点保护濒危野生药用动物林麝(Moschusberezovskii)雄性个体分泌。为了保护野生林麝资源，我国从1958年开始人工养麝。历经半个世纪，现仍处于试养阶段，麝香产量低[2]，其根本原因在于林麝选育程度低下，传统遗传育种方法费时费力，在林麝上实施起来有较大困难。家畜中，人们运用多态性位点关联分析[3-4]、分子标记辅助选择[5]等技术极大地提高了一些家畜的选育进程。纵观林麝的选育还较为原始，在家畜中研究得较为深入的多态性位点关联分析[6-8]还鲜有报道，因此本研究以多态性位点关联分析为实验方法，从遗传水平上揭示林麝产香性能机理，以期为加快林麝选育提供理论依据。FSHβ和LHβ基因是位于性腺轴上的关键基因，也是影响产香性能的候选基因[9]。在泌香过程中，垂体前叶碱性细胞分泌的糖蛋白激素FSH和LH作用于雄麝的性腺，通过调节雄性激素的分泌进而影响麝香的生成[10-11]。汪建隆等也证实FSHβ与LHβ影响麝香分泌[12]。然而在林麝群体中，FSHβ和LHβ基因及其上下游到底有多少个多态性位点还不得而知。【本研究切入点】研究利用Hiseq混池测序方法在林麝全基因组范围内进行多态位点筛选，重点关注FSHβ、LHβ基因及其上下游2 k区域，再结合所研究的林麝个体的产香数据做关联性分析，获得的显著性多态位点可运用于后续的分子标记辅助选择。【拟解决的关键问题】本研究对于了解林麝种群的遗传特性有重大意义，也对于提高麝香的产量具有实际的指导意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选取四川养麝研究所马尔康养獐场100头林麝为试验材料，统一于2018年10月集中采香，取尽每头林麝香囊中的麝香，现场称重记录，获取每头林麝的年产香数据。在取香前称取的每头林麝体重，对应采集每头林麝后肢静脉血管的2 mL血液用于提取DNA。

1.2 基因组DNA混池Hiseq测序

用天根血液DNA提取试剂盒(货号DP304)提取血液样本DNA，并用Nanodrop检测样本DNA质量和浓度。将提取的DNA样本均匀稀释至50 ng/μl，每个样品取2 μl均匀混合，构建试验林麝DNA混池构建文库。采用Illumina平台进行高通量测序，测序数据以ls35[13]为参考序列进行注释比对。

1.3 试验群体质谱分型

根据Hiseq检测到的潜在SNP位点，本实验采用飞行质谱检测方法对林麝个体进行基因分型。根据FSHβ和LHβ基因的20个SNP 已知的序列信息，设计引物，引物信息如表1所示。

表1 质谱引物信息

续表1 Continued table 1

1.4 数据处理与统计分析

使用Microsoft Excel 2013统计各个位点的等位基因频率、基因型频率、多态信息含量(PIC)、纯合度(Ho)、杂合度(He)和有效等位基因数(Ne)，并进行Hardy-Weinberg检验。

其中：NAA、NAB、NBB分别为群体中基因型为AA、AB、BB的个数。

其中,N为等位基因个数，P和Pi为第和第i个等位基因在群体中的频率。

其中,Pi和Pj分别为第i个和第j个等位基因频率，m为等位基因数。

采用SPSS 软件对个体基因型与麝香品质和产量数据进行关联分析，设定SPSS中最小二乘法拟合线性模型和Ducan法进行多重比较。考虑场效应，建立以下统计分析模型。

(1)单基因效应方差分析：Y=μ+G+p+e;

Y表示性状测定值，μ代表群体均值，G为基因型效应，p为场效应，e为随机残差。

(2)组合基因型效应方差分析：Y12=μ+G1+G2+G12+p+e;

Y12表示性状测定值，μ为群体均值，G1是第一个位点的基因型效应，G2是第二个位点基因型效应，G12是位点1和位点2的交互效应，p是场效应，e为随机残差。

2 结果与分析

2.1 Hiseq测序结果及SNP位点分析

利用Qubit Fluorometer对提取的林麝基因组DNA浓度和纯度进行检测，结果显示混池样品质量合格。结合体重与产香数据，去除提取DNA质量差的个体，在100个样品中，有74个样品符合实验要求。通过Illumina Hi-Seq2000测序平台，总共测得1014.48 G raw data，去除低质量reads和冗余数据后得到151.9 G clean data。以ls35为参考基因组[10]，整体比对率达到99.55 %，测序深度为52.49 X，覆盖率达到94.96 %。总共得到8259 941个SNP位点，其中98.91 %的突变位于基因间区内。

2.2 FSHβ和LHβ基因内SNP位点验证

结合参考基因组基因，本研究采用飞行质谱检测方法对林麝74个个体进行基因分型。根据候选基因FSHβ和LHβ序列(GeneBank：JN164268，JN164267)的已知信息，选择28个潜在SNP 位点进行质谱分析验证，20个成功分型，具体位点信息如表2所示，质谱分型结果如图1所示。说明基于高通量测序筛选的SNP位点大部分是可验证的。

表2 SNP位点位置信息

2.3 试验群体遗传学参数

对质谱分型成功的20个SNP位点进行多态性分析，结果表明，在74个样本中，SNP01和SNP03哈温P值均小于0.05，基因型频率分布显著偏离哈代-温伯格平衡，这些位点不作单倍型分析。其余位点均处于平衡状态(P>0.05)，详细结果见表 3。

表3 基因多态性分析

续表3 Continued table 3

续表3 Continued table 3

2.4 SNP与林麝产香性能的关联分析

通过单个SNP位点与产香性状进行关联分析表明，位于LHβ基因的9个SNP位点中，SNP13与林麝产香量性能显著相关(P<0.05)，TT为优势基因型。这些位点与体重的相关性均未达到显著水平(P>0.05，表4)。

位于FSHβ基因的9个SNP中，有2个SNP位点SNP15、SNP20与林麝产香量显著相关(P<0.05)，SNP15中AA为优势基因型，SNP20中TT为优势基因型。这些位点与体重的相关性也未达到显著水平(P>0.05，表5)。

3 讨 论

3.1 试验材料的选择

林麝为国家一级濒危保护动物，实验材料来源珍贵。本研究操作人员熟练了掌握林麝血液采集的方法，在尽量减少对林麝刺激的情况下，迅速采集林麝肢外周静脉血，为试验的开展提供了充足的研究原材料。

本研究材料来源地马尔康养獐场，为全国最大的人工养麝驯养基地，现存林麝800余头，有300多头公麝可作为试验对象，最大限度的反应了选择的研究样本能代表整体和种群的特征，对分析林麝个体的基因型，估测不同基因型对泌香性状的关联分析产生至关重要的影响。根据前期生产记录，本研究能充分了解这些个体的遗传特点，弄清他们之间的血缘关系，为杂种优势利用提供最佳配合力方面的信息，为今后更合理的开发利用这些公麝群体，提高泌香性能，选育高产群体奠定基础。

表4 LHβ基因与产香性状及体重的关联分析

表5 FSHβ基因与产香性状的关联分析

3.2 林麝泌香候选基因的选择

研究报道性腺轴激素与林麝的泌香有密切关系，主要通过下丘脑-垂体-性腺轴调控泌香过程，具体林麝泌香的途径如下：丘脑下部→LRH→垂体前叶→LH、FSH→睾丸间质细胞→雄性激素→麝香腺→分泌香液→麝香内转化→麝香。本研究选取了与泌香过程调控密切相关的2个候选基因(FSHβ、LHβ)进行泌香机制研究。林麝与其他哺乳动物的FSH和LH基因是共同起源的[9]，在泌香过程中垂体前叶碱性细胞分泌的糖蛋白激素FSH和LH作用于雄麝的性腺，通过调节雄性激素的分泌进而影响麝香的生成。汪建隆等[12]也证实FSH与LH影响麝香分泌。在分型过程中，本研究仅对上述基因的外显子和启动子区域进行了研究，没有对其内含子进行研究，研究不充分，还需进一步完善。

3.3 高通量筛选SNP位点的准确性

本研究在林麝全基因组水平上一共筛选了8 259 941个SNP位点，这对于深入研究其生物机理具有重要的理论意义。对产香候选基因FSHβ和LHβ的28个SNP 进行质谱分型，其中5个SNP位点由于技术原因质谱分型失败，3个SNP位点检测出来均无突变，其余20个SNP位点均成功分型，除去技术原因，分型成功率达87 %，因此本研究测得的SNP具有较高准确性。

3.4 LHβ基因多态性与产香性能的关联分析

本研究选择了LHβ基因的11个SNP位点进行验证，并将其多态性与林麝产香性能进行关联性分析。其中SNP01和SNP03的哈温P值均小于0.05，基因型频率分布显著偏离哈代-温伯格平衡。我们认为原因可能是，群体中人工选育对这一基因座的选择压力不强，所以要提高选择强度，进一步加强选育工作。其余9个SNP位点，通过单个SNP位点与产香性状进行关联分析表明，编号为SNP13的位点突变，与林麝产香量性能高度相关(P<0.05)。SNP13距离基因启动子3648 bp，位于基因下游1758 bp处，碱基C突变为了T。其中TT型个体相比于CC、CT型个体产香量存在极显著差异(P<0.01)，是优势基因型。林麝体重与LHβ的SNP未达到显著相关(P>0.05)，说明LHβ基因多态性对林麝的体重影响不大。

3.5 FSHβ基因多态性与产香性能的关联分析

在FSHβ基因上下游验证得到9个SNP位点，通过单个SNP位点与产香性状进行关联分析表明，分别位于基因上游1904 bp处的SNP15和1341 bp处的 SNP20与林麝产香量性显著相关(P<0.05)，SNP15中的AA型与GG型个体存在极显著差异(P<0.01)，是优势基因型。体重与FSHβ基因相关性也均未达到显著水平(P>0.05)，说明FSHβ基因多态性对林麝的体重影响不大。

4 结 论

本研究通过高通量测序对100只圈养林麝进行多态性检测，在全基因组范围得到了8 259 941个潜在SNP位点。利用质谱分型，对100只林麝进行质谱分型，结合体重与产香数据，去除提取DNA质量差的个体，发现只有74个样品符合实验要求。在FSHβ和LHβ基因中及上下游验证得到20个SNP位点，其中14个SNP位于基因的非编码区，并发现位于FSHβ基因上游的SNP15、SNP20和位于LHβ基因下游的SNP13与林麝泌香性能高度相关(P<0.05)。这些突变位点可作为分子标记运用于林麝的人工选育，并为高产香林麝群体培育选种提供辅助依据。