响应面法优化黄芪总黄酮的提取工艺研究

陈 港，王 婷，丁小琴，李 欠

（甘肃农业大学农学院/ 植物生产类国家实验教学示范中心，甘肃兰州730070）

中药黄芪是《中国药典》[1]中记录的常见中药，是蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根。现代研究表明：黄芪中主要含有黄酮类、皂苷类和多糖类等化学成分，具有多种药理作用[2]。黄芪在中医临床上可用于治疗糖尿病及其并发症、婴幼儿哮喘、脾胃虚寒型消化性溃疡、胃病等病症[3-6]，黄芪注射液可用于治疗小儿病毒性心肌炎、脓毒症等病症[7,8]。同时，黄芪还研发了多种具有保健功效的药品，符合大众的保健需求[9]。

通过查阅文献可知，黄芪甲苷以及黄芪多糖类成分的提取工艺研究较多[10,11]，而黄芪总黄酮的提取工艺研究较少，尤其是结合响应面法对提取工艺进行优化的研究更少。近年来，响应面法（Response Surface Methodology，RSM）作为一种非常重要的试验设计优化方法，在中药提取工艺优化等方面得到广泛的应用。响应面法是将影响提取试验结果的因素进行设计，然后按照设计方案进行试验得到试验结果。分析试验因素和试验结果之间的数学关系，进而得到最优的试验条件[12]。本文以黄芪中总黄酮的提取率为指标，采用超声提取的方法，结合响应面法优化黄芪总黄酮的提取工艺，最终得到最佳的提取条件。

1 实验仪器与材料

1.1 药材

黄芪药材购自黄河药材市场（产地甘肃），并经甘肃农业大学中药学教研室邱黛玉副教授鉴定为蒙古黄芪[Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mon gholicus（Bge.）Hsiao]。

1.2 试剂

芦丁对照品（纯度：98%），氢氧化钠、亚硝酸钠和硝酸铝均为分析纯。

1.3 仪器与设备

超声波提取仪、电子天平、真空泵、实验旋涡混合器和紫外可见分光光度计（T6，北京普析通用仪器有限责任公司）。

2 实验方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

本试验采用吕凤娇[13]等人的方法，首先精密称取10 mg 芦丁标准品置于容量瓶中，加入30%的乙醇准确定容于50 ml 的容量瓶中，得到浓度为0.2 mg/mL 的芦丁标准液。依次缓慢吸取芦丁标准液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml、4.0 ml、5.0 ml 置于10 ml 的容量瓶中，以下操作均以移液枪进行，以减少试验误差，首先吸取的5%NaNO2溶液0.3 ml，震荡均匀，静置6 min，使溶液处于稳定状态，再吸取10%Al（NO3）3溶液0.3 ml，震荡均匀，静置6 min，再吸取4%NaOH 溶液4.0 ml 震荡摇匀后静置15 min，最后用30%的乙醇定容，在波长510 nm 处用紫外可见分光光度计测定吸光值，同样用30%的乙醇溶液作对比，以吸光度（A）为纵坐标，芦丁浓度C（mg/ml）为横坐标，绘制标准曲线，进行线性回归[13]。

2.2 供试品溶液制备

称取1 g 左右的黄芪粉末，倒入提前洗干净并且烘干的锥形瓶中，按照不同的乙醇浓度、不同的液料比、不同的提取时间相同温度每3 个锥形瓶为1组进行超声提取，然后进行抽滤，收集滤液，按照顺序放在阴凉处备用。

2.3 黄芪中黄酮的含量测定

采用吕凤娇[13]等人的方法测定黄酮含量，吸取5 ml 上述一定试验条件下超声提取得到的供试品溶液置于10 ml 的容量瓶中，待测液配制方法同2.1，同样在波长510 nm 处测定吸光值。提取率按下式计算：

式中，R 为提取率，C 为黄芪中总黄酮的浓度，单位是mg/ml，n 为稀释倍数。

2.4 优化黄芪总黄酮提取工艺

2.4.1 黄芪中总黄酮提取工艺单因素考察 如表1 所示，每个试验水平条件下设3 个平行组，进行考察。

表1 单因素试验

2.4.2 响应面法优化黄芪中总黄酮提取工艺试验根据单因素试验结果，对影响提取结果的3 个因素进行Box-Behnken 试验设计，以黄芪中总黄酮的提取率（R）为响应值（见表2）。

表2 响应面试验设计

3 结果与分析

3.1 芦丁标准曲线的确定

根据上述“2.1”项下的方法绘制标准曲线，进而确定对照品浓度与吸光度之间的关系，A=12.69C－0.018 6，R2=0.999 3，结果表明：吸光度与浓度具有良好的线性相关关系，线性范围为0.02～0.12 mg/ml。

3.2 单因素试验结果

图1 为乙醇浓度对黄芪总黄酮提取率的影响，从图1 可以看出，乙醇浓度65%，提取率最大。图2为提取时间对黄芪总黄酮提取率的影响，从图2 可以看出，提取时间为40 min 时，提取率最大。图3 为液料比对黄芪总黄酮提取率的影响，从图3 可以看出，液料比为15 时，提取率最大。

图1 乙醇浓度对黄芪总黄酮提取率的影响

图2 提取时间对黄芪总黄酮提取率的影响

图3 液料比对黄芪总黄酮提取率的影响

3.3 响应面法优化黄芪中总黄酮试验结果

3.3.1 试验设计与结果 根据上述表2 试验条件进行试验，结果如表3 所示。

3.3.2 模型显著性分析 根据文献报道方法，本实验结果同样利用软件得到二次多项式回归方程，R=0.14+0.00575A+0.00275B-0.00375C-0.0005AB-0.01AC+BC-0.017 A2-0.014 B2-0.022 C2，决定系数（r2）=0.978 4，调整系数为0.950 7。表4 为方差分析结果，由方差结果可知，本试验所建立的模型具有极强显著性，而失拟项不具有显著性（P=0.458 5）。由回归方程可以看出，2 次项乙醇浓度A2、提取时间C2有极强的显著性，2 次项液料比B2为一般显著项，其他为不显著项。分析原因：一是做实验过程中提取温度没有控制相同，没有及时用温度计测量温度，导致最后对实验结果有影响；二是抽滤过程操作不够规范，导致供试液有误差；三是实验之前文献的查阅不够全面，最开始的单因素实验设置梯度有问题，导致最后响应面实验的结果有误差。因此，乙醇浓度对总黄酮提取率的影响最大，提取时间对提取率影响次之，液料比对提取率影响较小。

表3 响应面试验设计与结果

3.3.3 最佳提取工艺参数预测 首先，响应面的倾斜程度反应的是3 个因素（乙醇浓度、液料比、提取时间）对响应值（提取率）的影响程度，若坡度越陡，则因素间交互作用越显著。其次，曲面图的颜色反映的是因素间的变化趋势，若颜色越深，则变化趋势越明显，结果如图4。响应面优化结果表明：黄芪中总黄酮最优的提取工艺参数为乙醇浓度66.02%，液料比15.47，提取时间38.69 min。在这个条件下，黄芪中总黄酮的提取率为0.136 4%。

3.4 验证试验

在实际实验时，要重点考虑实际操作的可行性以及验证结果的准确性，所以将工艺参数人为调整：乙醇浓度66%，液料比15，提取时间37 min，同样的条件，做3 次重复试验，降低试验的误差，并且对最后结果求平均值，得到总黄酮的提取率为0.135%，与预测值0.136 4%仅仅相差了0.001 4 个百分点，表明该工艺参数下，提取率达到了最大值，经本试验优化后的提取工艺更加准确、可靠。

3.5 方法学考察

3.5.1 精密度考察 为了测定分光光度计的精密度，选取一份供试品溶液，连续测定6 次吸光度，计算其RSD 值，本实验RSD 为1.01%，表明仪器具有良好精密度，可以用于实验。

3.5.2 重复性试验 为了考察本实验方法的重复性，同一条件下准备6 份供试品溶液，测定其吸光度，计算其RSD 为0.98%，表明本方法具有良好的重现性。

3.5.3 稳定性试验 取1 份供试品溶液在0～12 h（间隔2 h）测定其吸光度的变化以考察其稳定性，本实验RSD 为1.67%，表明供试品溶液在12 h 内具有良好的稳定性。

4 结论

本试验以超声辅助响应面法优化黄芪中总黄酮的最佳提取工艺为目的。在单因素试验的基础上，再通过Box-Behnken 响应面法对实验数据进行拟合优化得到其最佳提取工艺。最后按照最佳的提取工艺做了3 组重复试验，证明了工艺的可靠性。在响应面法的优化下，黄芪中总黄酮的提取工艺更为充分、准确，可用于黄芪中黄酮类物质提取的工艺研究和质量评价。

表4 方差分析

图4 黄芪黄酮提取工艺优化响应面图