乌司他丁对创伤失血性休克大鼠肺炎症介质及其信号通路miR-146a调控TLR4/NF-κB的影响研究

应盼　　吴先龙　　杨志辉　　辛文伟

[摘要] 目的 探討乌司他丁对创伤失血性休克大鼠肺炎症介质及其信号通路miR-146a/TLR4/NF-κB的影响。 方法 将60只SD大鼠经股动脉放血制作休克模型，采用随机数字表法分为A、B、C三组，每组20只，其中A组不予复苏，B组休克后60 min给予醋酸钠林格液复苏，C组采用醋酸钠林格液联合乌司他丁复苏。采集大鼠复苏后肺组织，对肺组织中miR-146a、TNF-α、IL-1、IL-4、IL-6以及IL-10的mRNA水平予以检测，采用Western blotting对肺组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量予以检测，对三组大鼠肺组织病理学变化予以观察。 结果 与A组、B组相比，C组大鼠miR-146a、IL-4、IL-10 mRNA水平提高，TNF-α、IL-1、IL-6水平下降，差异有统计学意义（P<0.05）;三组大鼠肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平相比，C组低于A组、B组，差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 乌司他丁能够通过增强miR-146a表达复苏创伤失血性休克大鼠，对TLR4/NF-κB信号通路起到负反馈调控作用，维持促炎因子与抑炎因子平衡，对肺组织具有保护作用。

[关键词] 乌司他丁;创伤失血性休克大鼠;炎症介质; miR-146a;TLR4/NF-κB通路

[中图分类号] R392.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）10-0031-05

Research on the impacts of ulinastatin on the regulation of TLR4/NF-κB by pulmonary inflammatory mediators and the signaling pathway of miR-146a in rats with traumatic hemorrhagic shock

YING Pan   WU Xianlong   YANG Zhihui   XIN Wenwei

Department of Emergency， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou 318020， China

[Abstract] Objective To investigate the impacts of ulinastatin on miR-146a/TLR4/NF-κB by pulmonary inflammatory mediators and the signaling pathway in rats with traumatic hemorrhagic shock. Methods A total of 60 SD rats were subjected to femoral artery bloodletting to establish shock models， and they were randomly divided into group A（n=20）， group B （n=20） and group C （n=20）. Among which， group A was not resuscitated， group B was resuscitated with sodium acetate Ringer solution 60 min after shock，and group C was resuscitated with sodium acetate Ringer solution combined with ulinastatin. The mRNA contents of miR-146a， TNF-α， IL-1， IL-4， IL-6 and IL-10 in the lung tissue of rats after resuscitation were detected. The relative expression of TLR4 and NF-κB protein in the lung tissue was detected by Western blotting， and the pathological changes of lung tissues of the three groups of rats were observed. Results Compared with group A and group B， the mRNA indexes of miR-146a， IL-4 and IL-10 in group C were increased， while the levels of TNF-α， IL-1 and IL-6 were decreased， with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with group A and group B， TLR4 and NF-κB protein expression levels in group C were significantly lower than those in group A and group B， with statistically significant differences（P<0.05）. Conclusion Ulinastatin can resuscitate rats with traumatic hemorrhagic shock by enhancing the expression of miR-146a， play a negative feedback regulation role in TLR4/NF-κB signaling pathway，maintain the balance between pro-inflammatory factors and anti-inflammatory factors，and have protective efficacy on lung tissue.

[Key words] Ulinastatin; Rats with traumatic hemorrhagic shock; Inflammatory mediators; miR-146a; TLR4/NF-κB pathway

作為临床常见的危重症，创伤失血性休克主要是指创伤引起的机体大量失血、血容量降低、细胞代谢失调等病理现象，起病急、病情进展速度快，主要临床特点如下：①失血过多。失血是创伤性休克最常见的原因，因体内血液大量流失，就会导致全身的组织和器官缺氧。②患者机体组织遭到破坏。受到严重挤压就会导致患者组织出现缺血和坏死，从而引起休克。③细菌影响。患者受到创伤后就会出现细菌感染，而细菌又会产生很多的毒素，从而进入血液中，使患者出现休克。④神经内分泌紊乱。受到严重创伤后的患者会出现很多的症状，而这些症状又会导致中枢神经受到刺激，从而引发休克。若治疗不及时或治疗方案不当，将会导致机体微循环功能紊乱，威胁患者生命安全。

流行病学调查研究发现，创伤失血性休克死亡率高，主要与未能及时有效控制失血诱发的一系列炎症反应有关[1]。临床强调针对创伤失血性休克应积极改善微循环、控制失血、抑制炎症因子，以实现对患者病情的控制，防止全身炎症反应，挽救患者生命安全[2]。目前，国内外关于创伤失血性休克限制液体复苏及信号通路以减轻炎症反应报道较少，关于miR-146a表达是否参与肺组织炎症损伤调控尚不明确。作为液体复苏常用晶体液，醋酸钠林格液主要成分包括钠、钾、氯等，且离子浓度接近于血浆，在维持机体水电解质平衡、缓解组织损伤、扩容方面有着重要的作用[3]。作为尿胰蛋白酶抑制剂，乌司他丁具有免疫调节、平衡炎症作用，在胰腺炎、脓毒症等休克疾病诊断中已得到广泛应用[4]。失血性休克会对肺组织产生一定的损伤，同时也是最先累及的器官，因此从miR-146a/TLR4/NF-κB 信号通路方向，乌司他丁影响创伤休克大鼠肺部炎症机制切实可行。本研究选择60只大鼠构建创伤失血性休克模型，旨在分析乌司他丁对大鼠肺炎症介质及其信号通路miR-146a/TLR4/NF-κB的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1实验动物

60只健康SD大鼠购自南京君科生物科技有限公司，批号： SCXK 20090002，雌雄不限，体重210～280 g，平均（240±15）g;鼠龄6～9周，平均（7.31±0.33）周。将室温控制在25℃左右，湿度以40%～60%为宜。自清晨7：00至下午7：00实施12 h光照与黑暗周期交替，在该环境下饲养1周后进行实验。大鼠食物选择颗粒状，饮水随意。于上午7：00建立创伤失血性休克模型，严格按照医学实验动物护理及使用指南完成相关操作，经实验动物管理批准，符合医院医学伦理标准。

1.2 设备及试剂

采用生物信号采集处理系统medlab（南京卡尔文生物科技有限公司）;MH3180R高速冷冻离心机（长沙综仪生物科技有限公司）;美国伯乐bio-rad核酸蛋白测定仪SmartSpec Plus（上海蕴策生物有限公司）;Thermofisher 实时荧光定量PCR仪购自科至达（北京）信息技术有限公司;乌司他丁（常州天普制药有限公司，国药准字H19990131）;醋酸钠林格液（湖北多瑞药业有限公司，国药准字H20100138）。

1.3分组及模型建立

将60只大鼠随机分为三组，每组各20只。A组休克不复苏，B组给予醋酸钠林格液，C组给予醋酸钠林格液联合乌司他丁。三组大鼠鼠龄及体重比较，差异无统计学意义（P>0.05）。①休克模型构建：首先对大鼠进行称重，然后给予戊巴比妥钠50.25 mL/100 g（上海新亚药业有限公司，国药准字H31020240）、异氟醚1.0 mL/kg（河北一品制药股份有限公司，国药准字H19980141）腹腔注射进行麻醉，完成麻醉后，在手术台上将大鼠摆为仰卧位并予以固定，常规备皮、消毒、铺巾，将大鼠两侧腹股沟位置皮肤切开，对股动脉、股静脉进行钝性游离，置管并妥善固定，在其中注入枸橼酸钠注射液，确保管腔无堵塞，选择置于右侧股动脉的导管与生物信号采集系统连接，监测大鼠MAP。选择右侧股静脉完成液体复苏相关操作，左侧股动脉则建立休克模型，并将其连接微量泵。控制适宜的手术室温度，以25℃为宜。②复苏模型构建：完成置管后，静置20 min，采用2 mL注射器按照2 mL/min的速率从股动脉缓慢放血，直至血压维持在30～40 mmHg。回血采用缓慢、间断的方式，维持MAP在30～40 mmHg。60 min后A组不实施液体复苏，于左侧股静脉推注2 mL生理盐水，5 min内完成;B组休克后60 min右侧股静脉给予醋酸钠林格液输入;C组采用醋酸钠林格液联合乌司他丁复苏，选择左侧股静脉给予100 000 U/kg乌司他丁静脉推注，醋酸钠林格液500 mL/次。复苏后提取大鼠肺组织。实验期间采用微量泵经左侧股静脉泵入5 mL生理盐水。

1.4 肺组织炎症指标检测

提取肺组织标本后，按照要求完成总RNA分离及提取操作，所用方法为Trizol法，使其成为cDNA，实施qPCR扩增处理。扩增引物选择的是GAPDH，条件设置参照以往条件。预变性处理设置为95℃ 1 min;变性处理条件设置为95℃ 15 s，延伸条件为60℃ 30 s，循环次数为40次。绘制溶解曲线。完成反应后，对Ct值予以读取，对mRNA表达量予以计算。

1.5肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达

肺组织标本选择100 mg予以2～3次PBS冲洗，然后将其置于匀浆管壶腹部，剪碎，加入裂解液，在冰上进行研磨处理。提取肺组织蛋白，以12 000 r/min离心速率在4℃环境下实施离心处理，时间以10 min为宜，提取上清液，按照BCA蛋白质定量试剂盒分析蛋白质，并对蛋白浓度予以检测。实施SDS-PAGE凝胶电泳处理，使其成为PVDF膜。放置5%脱脂奶粉封闭液2 h 于摇床，添加一抗，设置温度为4℃，过夜。二抗加入前应实施3次TBST洗涤，孵育1 h，再次进行3次TBST洗涤膜。在暗室环境下经曝光、显影获得胶片，采用化学发光法检测蛋白相对表达量。

1.6 Western blotting检测

提取冻存的肺組织，经裂解处理收集匀浆，对组织蛋白浓度予以检测。然后实施电泳，其操作同1.5。孵育一抗anti-body由爱必信（上海）生物科技有限公司提供，二抗（酶标记-常用HRP）由上海瑞齐生物科技有限公司提供。再次洗涤膜。膜上条带密度采用化学发光法进行扫描，获得目标蛋白表达量。

1.7观察指标及评价标准

采用Western blotting对肺组织中TLR4、NF-κB蛋白相对表达量予以检测，对三组大鼠肺组织病理学变化予以观察。肺组织经固定、包埋及切片相关操作后，行HE染色，对其在光镜下的表现及变化予以观察，并做好相应的记录。

1.8 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计数资料以[n（%）]表示，组间比较采用χ2检验;符合正态分布的计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组大鼠肺组织炎症指标表达情况

在三组大鼠IL-4、IL-10以及miR-146a指标中C组最高，在促炎因子TNF-α、IL-1、IL-6水平表达中C组最低，三组比较差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2三组大鼠肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达比较

C组大鼠TLR4、NF-κB蛋白表达量明显低于A组、B组，差异有统计学意义（P<0.05），A组TLR4、NF-κB蛋白表达量明显高于B组，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3三组肺组织病理学改变情况

光镜下观察大鼠肺组织发现，A组存在肾小管明显扩张，伴随脱落及坏死细胞、上皮细胞肿胀，间质间有浸润炎症细胞;B组上皮细胞肿胀较轻，肾小管管腔扩张轻于A组，间质有散在炎症细胞;C组炎症减轻明显，仅存在零落炎症细胞。见封三图1。

3 讨论

创伤失血性休克病情急、死亡率高，对患者重要脏器产生直接损伤，当触及炎症瀑布样释放后，会加重免疫炎症调控系统紊乱，引起组织器官损伤。随着现代医疗卫生技术的进步，创伤失血性休克死亡率显著降低，但发病率居高不下，若处理不及时将会累及全身多个器官，诱发患者死亡[5-6]。针对创伤失血性休克多强调改善组织灌注，对机体炎症水平予以调节，防止造成不可逆损伤。本研究在限制性液体复苏基础上联合乌司他丁，与失血性休克救治理念相符。本研究肺组织病理结果显示，A组肺组织损伤最为严重，其次为B组，肺组织损伤程度最轻、改善最为明显的则是经乌司他丁干预的C组。

微循环障碍很大程度上是由于炎症介质的参与，与此同时，创伤应激也与炎症反应密切相关，当伴随失血性休克时会引起IL-1、IL-6以及TNF-α促炎因子释放[7]。作为抑炎因子，IL-4、IL-10表达增强可对促炎因子生成起到抑制作用，能够起到平衡炎症的作用，是肺组织的重要保护性因子。乌司他丁既往证实在胰腺炎患者机体中可对TNF-α、IL-6产生抑制，提高IL-10水平，提示该药物治疗脓毒症休克及胰腺炎可以改善炎症症状，发挥保护肺组织的作用[8]。本研究随访了不同组大鼠复苏后促炎因子及抑炎因子变化情况，结果显示采用乌司他丁与醋酸钠林格液联合复苏干预的C组大鼠miR-146a、IL-4、IL-10的mRNA水平升高，TNF-α、IL-1、IL-6水平下降，与A组、B组比较，差异有统计学意义（P<0.05），提示乌司他丁能够对促炎因子释放起到抑制作用，同时可刺激抑炎因子表达，在缓解肺组织炎症损伤方面具有显著的作用。miR-146a因其能够负向调节核因子κB（Nuclear factor κB，NF-κB）信号通路，在控制炎症反应及免疫调节中扮演重要角色，从而得到众多学者的关注[9-11]。以往研究发现，miR-146a同样可以通过不同的分子机制影响骨髓造血稳态的维持及肿瘤形成[12]。miR-146a调控下游基因表达的多样性和复杂性，反映了其可参与机体多个生物过程，发挥着重要的生物学作用。而miR-146a在不同疾病模型中表达水平各异，所介导的信号通路和所造成的最终结局也不尽相同[13-15]。临床实验表明，miR-146a能够通过对促炎因子IL-1、IL-6及TNF-α释放的抑制，发挥保护肺组织的作用[16-17]，可缓解创伤带来的炎症疼痛。合并缺血再灌注损伤则往往伴随miR-146a表达代偿性提高，使得NF-κB表达降低，IL-1、IL-6等促炎因子释放也会受到一定的抑制，提示机体缺血再灌注损伤治疗靶点可能为miR-146a，其过度表达会促进IL-6水平下降，通过对IL-10的抑制，诱导miR-146a表达[18]。TLR4活化会对TNF-α产生影响，TNF-α经活化作用会促进NF-κB转录活性增强。创伤失血性休克通过对机体信号通路的触发可刺激炎症介质释放，信号通路与炎症介质是相互影响的关系，但具体关系尚未得到证实[19]。本研究结果显示，C组miR-146a、IL-4、IL-10的mRNA水平升高，TNF-α、IL-1、IL-6水平下降，与A组、B组比较，差异有统计学意义（P<0.05），三组大鼠肺组织TLR4、NF-κB蛋白表达水平相比，C组最低，差异有统计学意义（P<0.05），提示乌司他丁通过对miR-146a的影响，对下游炎症因子表达起到调控作用，并对TLR4/NF-κB信号通路活化起到抑制作用，降低促炎因子水平，缓解肺组织损伤[20]。但基于miR-146a信号通路复杂性，其还需要大量的研究及数据支持，两者是否为因果关系，是否通过miR-146a进行调控，需要用细胞模型及RNA干扰等试验进一步验证。

综上所述，乌司他丁应用于创伤失血性休克大鼠可抑制miR-146a表达，抑制TLR4/NF-κB信号通路活化，缓解肺部炎症反应，可为乌司他丁临床应用提供理论依据。

[参考文献]

[1] 张蕾，李文澜，贾一帆，等.乌司他丁对失血性休克大鼠肺组织损伤的保护作用[J].现代药物与临床，2019，34（2）：276-280.

[2] 王振杰，陈硬，宋琦，等.乌司他丁通过miR-146a调节TLR4/NF-κB信号通路减轻失血性休克大鼠肾炎症损伤研究[J].蚌埠医学院学报，2020，45（3）：286-290，295.

[3] 姜远旭，夏明珠，丁登峰，等.乌司他丁对失血性休克/复苏-内毒素双重打击大鼠急性肝损伤的保护作用[J].中国急救医学，2016，36（12）：1116-1120，后插2.

[4] Lee JH，Jeon YD，Lee YM，et al.The suppressive effect of puerarin on atopic dermatitis-like skin lesions through regulation of inflammatory mediators in vitro and in vivo[J].Biochemical and Biophysical Research Communications，2018，498（4）：258-260.

[5] 徐志鹏，陈硬，宋琦， 等.醋酸钠林格液联合乌司他丁对失血性休克大鼠肝组织NF-κB p65蛋白表达及其细胞因子的影响[J].蚌埠医学院学报，2018，43（10）：1334-1338.

[6] 王兮，母前途，冯思嘉.基于TLR4/MyD88/NF-κB通路探讨乌司他丁减轻脂多糖诱导的大鼠急性肺损伤的作用[J].河北医学，2019，25（8）：1299-1304.

[7] Liu HX，Wang ES，Lin YM，et al.Neuroprotective effect of docosahexaenoic acid in rat traumatic brain injury model via regulation of TLR4/NF-Kappa B signaling pathway[J].The International Journal of Biochemistry and Cell Biology，2018，99（26）：64-71.

[8] 陆贝，于源泉，殷俊杰，等.过氧化物酶体增殖物激活受体-γ激动剂对急性胰腺炎大鼠肺损伤的保护机制研究[J].中国现代医生，2017，55（18）：38-41.

[9] 丁峰，刘晓萍.乌司他丁联合葛根素对大鼠急性肺损伤模型Toll样受体4表达的影响[J].中国临床药理学杂志，2018，34（11）：1342-1344，1360.

[10] Eman Al-Sayed， Gad HA， Mohamed El-Shazly，et al.Anti-inflammatory and analgesic activities of cupressuflavone from cupressus macrocarpa：Impact on pro-inflammatory mediators[J].Drug Development Research，2018， 79（1）：205-208.

[11] 郎志斌，范晓珍，林洪启，等.乌司他丁预先给药对体外循环大鼠急性肺损伤时AQP1和AQP5表达的影响[J].中华麻醉学杂志，2018，38（10）：1261-1265.

[12] Kaki A，Nikbakht M，Habibi AH， et al. Effect of aerobic exercise on innate immune responses and inflammatory mediators in the spinal cord of diabetic rats[J]. Comparative Exercise Physiology，2020，16（4）：1-10.

[13] 黃志刚，郭光伟，常亮，等.乌司他丁联合利多卡因对大鼠肺缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国现代医生，2012，50（33）：24-26.

[14] 王静，黄忠，魏尉，等.HMGB1在重症急性胰腺炎大鼠肺损伤中的表达及乌司他丁的干预效应[J].西部医学，2018，30（2）：174-177.

[15] 陶广华，刘向六，罗伟，等.右美托咪定联合乌司他丁对大鼠呼吸机相关性肺损伤的保护作用及机制[J].现代中西医结合杂志，2018，27（3）：240-244，298.

[16] 徐建安，李王安.乌司他丁治疗创伤失血性休克后多器官功能衰竭的效果[J].黑龙江医药，2019，32（6）：1267-1269.

[17] 李敏，刘晓田，谢云斌，等.CaN/NFATc4信号通路在VILI大鼠肺组织炎症反应中的作用[J].中华麻醉学杂志，2019，39（6）：761-764.

[18] 程中贵，孙杨.乌司他丁对失血性休克/复苏患者肺损伤的保护作用的研究[J].江西医药，2019，54（5）：540-542.

[19] 陈荣琳，曹枫，符少平，等.CD200调节重症中暑大鼠肺部炎症反应的信号通路初探[J].解放军医学杂志，2020， 45（3）：265-269.

[20] 彭官清，凌乔，余舒莹.miRNA-155对重症肺炎大鼠肺组织的保护作用及机制[J].重庆医学，2019，48（17）：2890-2894.

（收稿日期：2020-11-24）