利用EMS诱变创制抗除草剂粳稻新种质

王付华，李自超，王 亚，付 景，杨文博，尹海庆，王生轩，王越涛，白 涛，张 珍

(1.河南省农业科学院 粮食作物研究所，河南 郑州 450002; 2.中国农业大学 农学院，北京 100193;3.河南省农业科学技术展览馆，河南 郑州 450000)

水稻是我国主要粮食作物。当前，农业劳动力价格飙涨，水稻种植方式轻简化趋势明显，水稻直播省工省力，推广面积越来越大[1]。与传统移栽相比，直播稻田杂草种子和水稻种子生长同步，杂草生长快、种类多、密度大，容易滋生杂草稻[2]，杂草控制是制约水稻直播生产的关键。培育抗除草剂作物，便于大田杂草控制[3]。当前，转基因抗除草剂作物已大面积生产应用，主要有转基因抗除草剂玉米、棉花、油菜和大豆等饲料、油料作物[4]，而转基因水稻尚未在我国批准商业使用。因此，培育非转基因抗除草剂水稻十分必要。国外非转基因抗除草剂作物已有成功先例，如20世纪末选育成功的抗三氮苯的油菜、抗咪唑啉酮的玉米等[5-6]。非转基因抗除草剂作物所抗除草剂主要包括咪唑啉酮类、环己烯酮类、磺酰脲类、均三氮苯类、有机磷类和激素类等[7]。乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)是亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸等支链氨基酸合成中的关键酶，是多种除草剂的作用靶标，包括咪唑啉酮类(Imidazolinones， IMIs)、磺酰脲类(Sulfonylureas，SUs)、嘧啶硫代苯甲酸脂类(Pyrimidinylthio-benzoates，PTBs)、三唑并嘧啶类(Triazolopyrimidines，TPs)和磺酰胺羰基三唑啉酮类(Sulfonylamino-carbonyltriazolinones，SCTs)[8-9]。ALS抑制剂类除草剂与植物体内的ALS结合形成复合物，阻断底物进入酶活性位点通路，抑制ALS活性，使支链氨基酸合成受阻，破坏植物细胞正常生长，导致植物死亡[10-12]。ALS基因某些位点的突变会减弱ALS与除草剂的结合力，产生除草剂抗性。对以ALS为靶标的抗性杂草进行研究发现，ALS的突变主要发生在8个氨基酸位点[12]；在拟南芥中研究发现，ALS蛋白中有20多个位点的氨基酸替换会产生除草剂抗性[10-14]。

目前，水稻中已公开报道了多个抗除草剂ALS氨基酸突变位点。1993年，路易斯安娜州立大学农业中心通过EMS(甲基磺酸乙酯)诱变筛选到抗咪唑啉酮类除草剂的水稻种质AS3510，其ALS氨基酸突变为Gly-628-Glu(第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸)，利用AS3510选育出商业品种121CL、141CL[15]。利用EMS诱变丰产性品种Cypress，筛选到抗咪唑啉酮除草剂种质PWC16，其ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn，利用PWC16选育出商业品种CL161、141CL[16-17]，2002年美国的抗除草剂水稻实现商业生产，有效控制了当地杂草稻的危害。阿根廷学者用EMS诱变当地水稻品种IRGA417也筛选到抗咪唑啉酮类除草剂材料，选育出抗咪唑啉酮品种PUTA INTA CL，其ALS氨基酸突变为Ala-96-Thr[18]。OKUZAKI等[19]以双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)筛选水稻品种台中65的花药培养愈伤组织，获得1个抗磺酰脲类除草剂的突变体，ALS氨基酸突变为Gly-95-Ala。近年来，我国多个研究单位筛选到ALS突变抗除草剂材料，深圳兴旺生物种业有限公司用EMS诱变黄华占和黄丝占，以咪唑啉酮类除草剂筛选，获得3个抗性突变体(Tyr-548-Me/Cyst、Ala-96-Val/Thr、Ser-627-An)[20]。赵炳然等[21]以咪唑乙烟酸筛选EMS诱变的籼稻品种华航31，获得4个抗性突变体，ALS氨基酸突变为Ala-179-Val、Ser-627-Asn、Gly-628-Glu、Val-643-Met。江苏省农业科学院利用甲咪唑烟酸筛选经EMS诱变的多个粳稻、籼稻品种，获得多个抗除草剂突变体，ALS氨基酸突变包括Gly-136-Thr、Pro-171-His、Ala-179-Val、Ser-627-Asn、Gly-628-Glu等[22-25]。用除草剂筛选品种资源，王芳权等[26]从7 000多份水稻种质资源中筛选到1份抗咪唑啉酮除草剂的材料，ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn；毕俊国等[27]以咪唑乙烟酸筛选30 000份水稻种质，同样获得1份ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn的抗性材料。综上可见，以往的抗除草剂水稻材料筛选以抗咪唑啉酮类除草剂为主。烟嘧磺隆是磺酰脲类除草剂，高效、低毒、便宜，能杀灭大田主要禾本科杂草和部分阔叶杂草，即“禾阔双杀”，是玉米田前期主要除草剂，但水稻易受伤害。如果能通过诱变筛选到抗烟嘧磺隆的水稻新材料，创制抗除草剂新品种，对现实生产意义重大，但目前尚未见相关报道。为此，以自育直播粳稻品种郑稻19为材料，采用EMS进行诱变，然后用甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆筛选抗除草剂水稻新种质，为选育非转基因抗除草剂水稻品种奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试水稻材料为粳稻品种郑稻19(Zhengdao 19)，由河南省农业科学院粮食作物研究所选育。EMS购自Sigma-Aldrich公司。甲咪唑烟酸铵盐水剂(240 g/L)购自登封市金博农药化工有限公司，三叶期杂草常规用量为300～450 mL/hm2。烟嘧磺隆可分散油悬浮剂(40 g/L)购自江苏长青生物科技有限公司，三叶期杂草常规用量为750～1 500 mL/hm2。

1.2 EMS诱变处理

干种子EMS处理方法参照WU等[28]和TILL等[29]的方法稍有改动。干种子于室温浸种16 h，滤干水，分别用0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.6%EMS溶液(EMS溶液用0.1 mol/L磷酸缓冲液配制，pH值7.2)于26 ℃恒温摇床(60 r/min)中浸泡8 h(每个剂量处理200粒种子)，然后在28 ℃发芽箱中催芽36～48 h，调查发芽率，确定半致死浓度，然后以该浓度对干种子进行处理(同上)，在28 ℃发芽箱中催芽36～48 h，之后播种。采用常规湿润育秧，常规单本插植，M1成熟时每株收获一穗，不脱粒，晒干。

1.3 抗除草剂突变体筛选

M2幼苗三叶期时，喷施112.5 g/hm2的24%甲咪唑烟酸筛选抗除草剂突变体，喷施60 g/hm2烟嘧磺隆筛选抗烟嘧磺隆突变体，处理14 d筛选抗除草剂的M2家系，筛选标准：相比绝大部分敏感株系能正常生长，株高接近正常，叶色偏绿。2017、2018、2019年连续3 a用甲咪唑烟酸筛选M2家系，2017年筛选3 000份，2018、2019年各筛选30 000份M2家系；2019年以烟嘧磺隆筛选30 000份M2家系。

M2抗除草剂突变体家系加代时用除草剂筛选，筛选方法同上，选择幼苗生长正常无死苗的家系留种。

1.4 抗除草剂突变体ALS基因克隆和序列分析

根据NCBI网站日本晴(Nipponbare)ALS基因序列(Os02g30630)设计扩增ALS基因全长的引物ALS-F(5′-GACCCACCTGTCATCCTCATCC-3′)和ALS-R(5′-ACATACAAACATCATAGGCATACCACT-3′)。以M3抗除草剂突变体纯合家系及郑稻19基因组DNA为模板，采用TaKaRa PrimeSTAR®Max DNA Polymerase扩增ALS基因。25 μL反应体系：2×PrimeSTAR®MaxPremix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1.0 μL，基因组DNA 2.0 μL，补加ddH2O至25 μL。PCR扩增程序： 98 ℃ 10 s，62 ℃ 15 s，68 ℃ 2.5 min，30个循环；68 ℃ 5 min。取5 μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA片段大小符合预期时，剩余PCR产物送宝生物工程(大连)有限公司进行克隆并测序。根据测序结果，采用DNAStar-MegAlign软件分析野生型和突变体ALS基因的DNA 序列差异，确定抗除草剂突变体的ALS基因突变位点。

1.5 突变体后代家系抗除草剂性能鉴定

用营养钵(17 cm×10 cm×10 cm)装过筛细土，将M3纯合家系种子和郑稻19种子播于土表，每钵播种子100粒，播后盖细土，厚约1 cm，营养钵放置于整理箱中(保持水深3 cm)，整理箱置于人工气候室中，光强10 000 lx，光12 h/暗12 h，温度25～28 ℃，相对湿度70%～85%。一叶期时间苗，每营养钵留生长一致的幼苗30株。三叶期时，分别喷施56.25、112.5、225、450、900 g/hm2甲咪唑烟酸，15、30、60、120、240 g/hm2的烟嘧磺隆，以喷水为对照；14 d后调查秧苗的生长情况，称取6株秧苗鲜质量，3次重复，计算各处理的鲜质量减退率，计算公式为：鲜质量减退率=(对照组每株鲜质量-处理组每株鲜质量)/对照组每株鲜质量×100%。

2 结果与分析

2.1 郑稻19干种子EMS诱变剂量的确定

由表1可知，随EMS用量增加，郑稻19种子发芽率下降，0.8%、1.0%、1.2%EMS处理下发芽率分别为60.2%、51.3%、39.0%，1.0%为半致死剂量。因此，确定以1.0%EMS进行诱变处理。

表1 郑稻19干种子径不同体积分数EMS处理后的发芽率Tab.1 Germination rate of dry Zhengdao 19 seeds after treated by different concentrations of EMS %

2.2 水稻抗除草剂突变体的筛选

M2幼苗三叶期，喷施甲咪唑烟酸，喷施后14 d，敏感植株叶片黄化、生长明显受抑制；抗除草剂植株能正常生长，株高明显高于敏感植株，叶色偏绿(图1A—F)。2017—2019年用甲咪唑烟酸共筛选63 000份M2家系，获得抗除草剂突变体6份，其中2017年1份(HF1，图1A)、2018年2份(HF2、HF3，图1B、C)、2019年3份(HF4、HF5、HF6)(图1D、E、F)。综上，甲咪唑烟酸处理后，HF1 HF2、HF3、HF4、HF5和HF6生长正常，说明这些突变体具有良好的抗甲咪唑烟酸性。

2019年用烟嘧磺隆筛选M2家系30 000份，三叶期喷施烟嘧磺隆，喷施后14 d，敏感植株叶片枯黄、植株矮小，停止生长，逐渐死亡；抗性植株生长受抑制，再过7 d慢慢恢复正常生长，共筛选获得抗除草剂突变体2份(HF7和HF8)(图1G、H)。综上，烟嘧磺隆处理后，HF7和HF8表现受害症状，但能逐渐恢复正常生长，说明这些突变体具有抗烟嘧磺隆能力。

A—F： 抗甲咪唑烟酸突变体；G—H：抗烟嘧磺隆突变体。A:HF1; B:HF2; C:HF3;D:HF4; E:HF5; F:HF6; G:HF7; H:HF8A—F:Imazapic-risistant mutants; G—H:Nicosulfuron-risistant mutants.A:HF1; B:HF2; C:HF3;D:HF4; E:HF5; F:HF6; G:HF7; H:HF8图1 水稻M2抗除草剂突变体筛选Fig.1 Screening of herbcide-resisitant rice mutants in M2

2.3 水稻抗除草剂突变体ALS基因序列分析

ALS是咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂的靶标，为鉴定突变体ALS基因突变位点，对M3抗除草剂突变体和郑稻19全长ALS基因序列进行分析，发现抗除草剂突变体及郑稻19的ALS基因ORF(Open reading frame)全长均为1 935 bp，没有内含子，编码644个氨基酸。比对抗除草剂突变体、郑稻19和日本晴的ALS基因编码序列(图2)，发现郑稻19 与日本晴ALS基因序列相同。HF2和HF5的ALS基因第1880位碱基由G突变为A，使得ALS第627位氨基酸由丝氨酸突变成了天冬酰胺(Ser-627-Asn)；HF1、HF3、HF4和HF6的ALS基因第1883位碱基由G突变为A，使得ALS第628位氨基酸由甘氨酸突变为谷氨酸(Gly-628-Glu)(图2)。突变体ALS基因的碱基突变导致其编码蛋白质关键位点氨基酸突变，使得突变体获得抗甲咪唑烟酸能力。HF7的ALS基因第511位碱基由C突变为T，使得ALS第171位氨基酸由脯氨酸突变为丝氨酸(Pro-171-Ser)；HF8的ALS基因第536位碱基由C突变为T，使得ALS第179位氨基酸由丙氨酸突变为缬氨酸(Ala-179-Val)(图2)。这2个位点的突变使HF7、HF8获得抗烟嘧磺隆能力。

红框为ALS蛋白171位、179位和628位差异氨基酸，黄框为627位差异氨基酸，下划红线、黄线分别为相应的DNA差异碱基The red boxes indicate the mutated amino acids at sites 171,179 and 628 of the ALS protein,the yellow box indicates the mutated amino acids at site 627,and the underlined red or yellow lines indicate the corresponding discrepant DNA bases图2 水稻抗除草剂突变体HF1—HF8与郑稻19、日本晴ALS基因序列及编码氨基酸序列比对(只显示差异部分序列)Fig.2 Alignment of ALS gene sequence and encoded amino acid sequence of herbcide-resisitant rice mutants HF1—HF8,Zhengdao 19 and Nipponbare(only showing the discrepant sequence)

2.4 M2家系抗除草剂突变体出现频率

3 a用甲咪唑烟酸筛选63 000份M2家系，获得ALS氨基酸突变为Ser-627-Asn的材料2份、Gly-628-Glu的材料4份，突变频率分别为0.003 2%、0.006 3%，相当于获得单碱基突变所致抗除草剂突变体分别需M2家系31 500、15 750份(表2)。用烟嘧磺隆筛选30 000份M2家系，获得2份抗性突变体材料，单个碱基位点突变频率为0.003 3%(表2)。特定位点抗除草剂突变频率平均为0.004 0%，即筛选到ALS特定单碱基突变需M2家系23 250份(表2)，预示筛选30 000份M2家系能获得所希望的抗除草剂单碱基突变。

2.5 抗咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂突变体的抗性鉴定

选择纯合HF1(Gly-628-Glu)、HF2(Ser-627-Asn)M3家系，三叶期分别喷施56.25、112.5、225、450、900 g/hm2甲咪唑烟酸和15、30、60、120、240 g/hm2烟嘧磺隆。14 d后，随着喷施剂量增加，喷施甲咪唑烟酸处理的郑稻19生长明显受抑制，生长逐渐停止，缓慢死亡，鲜质量减退率分别为36.91%、47.81%、47.87%、51.80%、58.71%。在1倍大田常规除草剂用量(112.5 g/hm2)下，突变体HF1、HF2鲜质量减退率分别为13.09%、20.03%，显著小于郑稻19(P<0.05，图3—4)；HF1、HF2在900 g/hm2剂量(8倍大田常规除草剂用量)下生长仍正常，郑稻19在4倍大田常规除草剂用量(450 g/hm2)下已死亡(图3E)。说明突变体具有强的甲咪唑烟酸抗性。

表2 M2家系ALS抗除草剂位点突变频率Tab.2 Mutation frequency of herbicide-resistant sites of ALS in M2 lines

A—F：甲咪唑烟酸剂量分别为0、56.25、112.5、225、450、900 g/hm2A—F:Imazapic doses are 0， 56.25,112.5,225,450,900 g/ha respectively图3 突变体HF1和HF2在不同剂量甲咪唑烟酸下的抗性鉴定Fig.3 Resistance identification of HF1 and HF2 mutants under different doses of imazapic

喷施烟嘧磺隆处理的郑稻19生长停滞，逐渐死亡，鲜质量减退率分别为52.48%、54.77%、60.19%、60.20%、61.48%(图5—6)。在30 g/hm2和60 g/hm2烟嘧磺隆下，突变体HF1、HF2鲜质量减退率分别为24.81%、13.13%和34.13%、28.01%，显著小于郑稻19(P<0.05)，超过60 g/hm2突变体HF1、HF2鲜质量减退率与郑稻19差异变小，说明突变体具有一定烟嘧磺隆抗性。HF2鲜质量减退率始终低于HF1，说明HF2突变体比HF1突变体有更强的烟嘧磺隆抗性。

图4 突变体 HF1和HF2在不同剂量甲咪唑烟酸下的鲜质量减退率Fig.4 The fresh weight reduction rate of HF1 and HF2mutants under different doses of imazapic

A—F:烟嘧磺隆剂量分别为0、15、30、60、120、240 g/hm2A—F:Nicosulfuron doses are 0，15,30,60,120,240 g/ha respectively图5 突变体HF1和HF2在不同剂量烟嘧磺隆下的抗性鉴定Fig.5 Resistance identification of HF1 and HF2 mutants under different doses of nicosulfuron

图6 突变体 HF1和HF2在不同剂量烟嘧磺隆下的鲜质量减退率Fig.6 The fresh weight reduction rate of HF1 and HF2 mutants under different doses of nicosulfuron

3 结论与讨论

3.1 抗除草剂突变体筛选

利用EMS诱变群体筛选抗除草剂突变体，一般在M2—M4进行[28-30]，早代选择能减少加代次数，减轻工作量，M2是变异最大的世代，在M2进行抗性筛选是有利的。从M1植株上收获M2种子时可以选择混收[31]，也可按家系收。本研究每个M2家系收1个单穗，2017年筛选3 000 M2家系，分株系(单穗)常规密度(8.6穗/m2)播种，占用秧田面积达350 m2，筛选到抗性突变体1份；2018、2019年单穗高密度种植(45穗/m2)，分别筛选30 000、60 000份M2家系，每30 000份材料播种面积控制在700 m2，极大地压缩了筛选用秧田面积，2018、2019年分别筛选到抗性突变体2、5份，说明高密度稻穗直接播种筛选苗期抗除草剂突变体可行，大幅减轻了工作量。另外，M2单穗分株系播种，抗除草剂突变体以家系整体出现，易于鉴别，也减轻了后期突变体鉴定工作量(混收混种时同一M2抗性突变体家系幼苗随机分布大田，多个突变单株可能来自同一个M2株系，增加鉴别难度，也增加后期突变体抗性鉴定、基因克隆等工作)。

3.2 抗除草剂突变体的出现频率

大剂量EMS处理，突变频率高，容易获得足量的点突变，广泛用于构建饱和突变体库，如用于TILLING[28-30，32]。WU等[28]估计较大剂量(0.8%～1.0%)EMS诱变水稻，每个M2家系平均有100个以上的突变位点。TILL等[29]以1.5%EMS处理粳稻品种日本晴，发现每294 kb DNA片段有1个碱基突变。MARTN等[30]利用高剂量EMS处理获得拟南芥突变体库，通过TILLING检测14个基因的突变事件，发现每个基因平均有16个错义突变，即每89 kb DNA片段有1个碱基突变。本研究中，以半致死剂量(1.0 %)EMS处理水稻干种子，用甲咪唑烟酸筛选63 000份M2家系，得到6份抗性突变体材料，包括2个突变位点，即Ser-627-Asn、Gly-628-Glu，突变频率分别为0.003 2%、0.006 3%，相当于获得单碱基突变所致抗除草剂突变体分别需M2家系3 1500、15 750份。以烟嘧磺隆筛选30 000份M2家系，获得2份抗性突变体材料(Pro-171-Ser、Ala-179-Val)，单个位点突变频率为0.003 3%。特定位点抗除草剂突变频率平均为0.004 0%，即筛选到ALS特定单碱基突变需M2家系23 250份。这为EMS诱变时M2群体规模的控制和筛选家系数量的确定提供了参考。

3.3 ALS基因突变及对除草剂的靶标抗性

杂草对ALS抑制剂类除草剂的抗性包括非靶标抗性和靶标抗性，靶标抗性主要指由于靶标酶基因突变，靶标酶与除草剂结合受阻，或靶标酶增强表达而产生抗性；非靶标抗性是指通过减少除草剂的吸收传导、提高除草剂的代谢及屏蔽隔离除草剂等方式产生抗性[14]。

ALS基因突变导致编码蛋白质序列关键位点出现氨基酸替换，改变酶与除草剂结合能力，除草剂除草能力降低或丧失[10-11]。对以ALS为靶标的抗性杂草研究发现，ALS的突变主要发生在8个氨基酸位点：Ala-122、Pro-197、Ala-205、Asp-376、Arg-377、Trp-574、Ser-653和Gly-654[12]；在拟南芥中研究发现，ALS蛋白中有20多个位点的氨基酸替换会产生除草剂抗性，不同位点突变所抗除草剂种类有差异[13-14]。水稻中已公开报道的ALS抗除草剂突变位点至少有Gly-95、Ala-96、Gly-136、Pro-171、Ala-179、Trp-548、Ser-627、Gly-628、Val-643等[15-27]。本研究通过用除草剂筛选EMS诱变的郑稻19 M2家系，获得8份抗除草剂突变体材料，包括4种突变类型。Ser-627-Asn和Gly-628-Glu突变类型材料主要抗咪唑啉酮类[14]，本研究中HF1、HF2在喷施8倍大田常规除草剂剂量的甲咪唑烟酸(900 g/hm2)后仍能正常生长，表现强的除草剂抗性，是优良抗除草剂材料，可作为抗性基因供体用于抗除草剂品种选育。研究报道，用咪唑啉酮类除草剂筛选到的ALS基因突变抗性水稻系AS3510(Gly-628-Glu)，还对多种磺酰脲类除草剂产生抗性[33]。本研究发现，对抗甲咪唑烟酸突变体HF1、HF2分别喷施1倍(30 g/hm2)、2倍(60 g/hm2)大田常规除草剂剂量的烟嘧磺隆，鲜质量减退率显著小于郑稻19，说明HF1、HF2兼具一定烟嘧磺隆抗性。本研究筛选的2个抗烟嘧磺隆突变体HF7(Pro-171-Ser)和HF8(Ala-179-Val)，在喷施60 g/hm2烟嘧磺隆后表现前期受抑制，但能缓慢恢复，说明有一定抗性。这与前期报道的拟南芥中ALS氨基酸Ala-205(水稻Ala-179)、Pro-197(水稻Pro-171)位点突变产生磺酰脲类除草剂抗性[14]一致。研究证明，在1个材料中使ALS基因2个或2个以上抗性位点同时突变，能增强除草剂抗性[34-35]，是创制强抗除草剂材料的有效途径。设想未来利用获得的抗性突变体进行二次诱变，筛选多位点突变抗除草剂材料，以增强抗性，获得能应用于生产的抗烟嘧磺隆种质；或通过基因编辑创制多位点突变的强抗烟嘧磺隆材料。