柠檬醛型樟组植物优良单株的筛选

张北红，肖祖飞，张海燕，侯杰希，王颜波，李 凤，吕雄伟，金志农，①

〔1.南昌工程学院水利与生态工程学院 江西省樟树繁育与开发利用工程研究中心，江西 南昌 330099；2.国家林业和草原局木本香料(华东)工程技术研究中心，江西 南昌 330045〕

柠檬醛是食品、香料和医药等领域的重要原料[1-3]，极具市场价值和开发潜力。国内的天然柠檬醛主要来源于山鸡椒〔Litseacubeba(Lour.)Pers.〕的花、叶和果皮[4-5]，而天然柠檬醛长期存在市场供应不足的问题，因此，亟需拓展来源植物资源。

迄今为止已发现十余种富含柠檬醛的植物，其中樟属(CinnamomumSchaeff.)樟组〔Sect.Camphora(Trew)Meissn.〕植物占近一半[6]。研究表明：樟组植物不同种群及个体间叶片的精油得率和主要化学成分相对含量均存在差异[7]，因此，有必要对各化学型樟组植物进行优良单株筛选。目前关于芳樟醇型、异橙花叔醇型、桉叶油素型和脑樟型等香樟〔C.camphora(Linn.)Presl〕常见化学型的优良单株筛选及等级划分标准已有报道[8-9]，但未见关于柠檬醛型香樟及其他樟组植物优良单株筛选的报道。

自然界中，柠檬醛型樟组植物的分布概率很低，如柠檬醛型香樟的分布概率不足万分之一，柠檬醛型猴樟(C.bodinieriLévl.)和黄樟〔C.parthenoxylon(Jack)Meisn.〕的分布概率约30%，柠檬醛型沉水樟〔C.micranthum(Hay.)Hay.〕和细毛樟(C.tenuipilumKosterm.)的分布概率低于10%[10]，筛选柠檬醛型樟组植物优良单株对于满足柠檬醛市场需求具有重要意义。为此，以广西、江西、广东、云南、湖北和四川的48株野生柠檬醛型香樟、黄樟、细毛樟和猴樟为研究对象，对供试样株叶片精油得率及精油中柠檬醛相对含量进行了比较，在此基础上筛选优良单株，以期为柠檬醛型樟组植物的开发利用及优良单株等级划分标准的制定提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

采用闻香法[10]对广西、江西、广东、云南、湖北和四川的野生香樟、黄樟、细毛樟和猴樟进行化学型初判，确定柠檬醛型植株并编号，采集地和样株信息见表1。样株种类和化学型均由江西省樟树繁育与开发利用工程研究中心金志农研究员鉴定。

表1 供试柠檬醛型樟组植物的采集地和样株信息

主要仪器：自主研发的便携式水蒸气精油蒸馏提取设备(专利授权号：ZL201720260199.0)；MA150快速水分测定仪(德国Sartorius公司)；BSA4202S-CW精密电子天平(德国Sartorius公司)；7890B-5975C气相色谱-质谱联用仪(美国Aglient公司)。

1.2 方法

1.2.1 采样方法 在2017年至2019年每年的5月中旬晴天日9：00至11：00，采用全株采样法[11]采集健康、无病虫害的当年生叶片。采样时，将树冠分成上、中、下3层，在各层的东、南、西、北向采集叶片，同株叶片充分混匀，4 ℃保存、备用。

1.2.2 叶片含水率测定 每株样株随机选3份叶片，每份6枚；沿叶中脉切开，切成面积约1 cm×1 cm的小块；使用快速水分测定仪测定叶片含水率。

1.2.3 精油提取及检测分析 每株样株称取3份叶片，每份200 g；采用水蒸气蒸馏法[12]提取精油，称量精油质量，4 ℃避光保存。将同一样株的3份精油样品等体积混匀，使用气相色谱-质谱联用仪进行检测分析，进样量1.0 μL，检测条件与文献[12]一致。

根据检测结果计算叶片精油得率，计算公式为叶片精油得率=(精油质量/叶片鲜质量)×(100%-叶片含水率)。采用文献检索法[13-14]，通过NIST标准谱库检索，采用保留指数进行定性分析，利用峰面积归一化法[15]计算精油中柠檬醛的相对含量。

1.2.4 优株筛选 参照相关文献[8-9]的筛选方法，以各样株叶片精油得率和柠檬醛相对含量的平均值(X0)为基准、标准差(SD)为叠加值，将供试样株分成4个等级，各等级叶片精油得率和柠檬醛相对含量(X)如下：一级，X≥X0+2.0SD；二级，X0+1.5SD≤X

根据样株选优指标(λ)筛选优良单株，λ的计算公式为λ=叶片精油得率×柠檬醛相对含量×10 000。将所有初选优株的λ均值作为平均选优指标(λ0)。初选优株也分成4个等级，各等级的λ值如下：一级，λ≥λ0+2.0SD；二级，λ0+1.5SD≤λ<λ0+2.0SD；三级，λ0+SD≤λ<λ0+1.5SD；四级，λ0≤λ<λ0+SD。λ<λ0，不定级。λ值在一至四级的样株为最终的优良单株。

1.3 数据处理及统计分析

使用SPSS 22.0软件对叶片精油得率和柠檬醛相对含量进行单因素方差分析，使用EXCEL 2017软件计算均值和变异系数等指标[16]。

2 结果和分析

2.1 柠檬醛型樟组植物叶片精油得率及精油中柠檬醛相对含量的比较分析

柠檬醛型樟组植物叶片精油得率及精油中柠檬醛相对含量的比较结果见表2。由表2可以看出：编号NM-22的样株叶片精油得率最高，达3.64%；编号NM-45的样株叶片精油得率最低，仅0.15%；并且，前者为后者的24.3倍。编号NM-42的样株柠檬醛相对含量最高，达77.13%，编号NM-32的样株柠檬醛相对含量最低，仅13.65%；并且，前者为后者的5.7倍。方差分析结果表明：样株间的叶片精油得率存在极显著(P<0.01)差异。供试样株叶片精油得率的均值为1.35%，变异系数为58.78%；柠檬醛相对含量的均值为47.62%，变异系数为30.38%。

表2 柠檬醛型樟组植物叶片精油得率及精油中柠檬醛相对含量的比较

由表2还可以看出：不同种类叶片精油得率和柠檬醛相对含量的均值存在差异。从各种类叶片精油得率的均值看，香樟最高(1.79%)、黄樟次之(1.64%)、猴樟较低(1.04%)、细毛樟最低(0.66%)。从各种类柠檬醛相对含量的均值看，细毛樟最高(56.56%)、黄樟次之(51.76%)、猴樟较低(45.10%)、香樟最低(43.37%)。

由表2还可以看出：不同省(自治区)叶片精油得率和柠檬醛相对含量的均值也存在差异。各省(自治区)叶片精油得率均值从高到低依次为广东、广西、江西、四川、湖北、云南，柠檬醛相对含量均值从高到低依次为广东、云南、江西、湖北、广西、四川。值得注意的是，不同省(自治区)同种类叶片精油得率和柠檬醛相对含量的均值存在差异，如采自广西的香樟叶片精油得率均值为1.82%，柠檬醛相对含量均值为46.73%，而采自江西的香樟叶片精油得率均值为1.76%，柠檬醛相对含量均值为40.00%。同省(自治区)不同种类叶片精油得率和柠檬醛相对含量的均值也存在差异，以采自江西的香樟和黄樟为例，黄樟叶片精油得率均值(1.44%)低于香樟，其柠檬醛相对含量均值(50.23%)高于香樟。

2.2 柠檬醛型樟组植物初选优株的确定

分别对供试48株柠檬醛型樟组植物的叶片精油得率和柠檬醛相对含量进行分级，获得初选优株，结果见表3。

由表3可以看出：叶片精油得率在一至四级的样株有22株，包括4株香樟(占香樟样株总数的66.7%)、11株黄樟(占黄樟样株总数的61.1%)和7株猴樟(占猴樟样株总数的30.4%)；柠檬醛相对含量在一至四级的样株有27株，包括3株香樟(占香樟样株总数的50.0%)、12株黄樟(占黄樟样株总数的66.7%)、1株细毛樟(占细毛樟样株总数的100.0%)和11株猴樟(占猴樟样株总数的47.8%)。统计结果表明：叶片精油得率和柠檬醛相对含量均在一至四级的样株有14株，编号分别为NM-2、NM-4、NM-8、NM-9、NM-11、NM-14、NM-16、NM-19、NM-21、NM-22、NM-24、NM-26、NM-29和NM-33，这些样株均为初选优株。

表3 柠檬醛型樟组植物初选优株的筛选结果1)

2.3 柠檬醛型樟组植物优良单株的选择

计算上述初选优株的选优指标(λ)，并依据平均选优指标(λ0)和标准差(SD)对初选优株进行分级，在此基础上选出优良单株，结果见表4。

表4 柠檬醛型樟组植物优良单株的筛选结果

由表4可以看出：一级优良单株仅1株，编号为NM-46；二级优良单株无入选样株；三级优良单株也只有1株，编号为NM-8；四级优良单株有6株，编号分别为NM-2、NM-4、NM-9、NM-11、NM-16和NM-24；不定级的样株有6株，编号分别为NM-14、NM-19、NM-21、NM-26、NM-29和NM-33。

3 讨论和结论

研究结果表明：供试柠檬醛型樟组植物的叶片精油得率和柠檬醛相对含量在不同种类、个体及产地间均存在差异，这与各样株的内在遗传因子和外界环境因子(坡位、坡向、土壤等)均有关[11，17-18]。猴樟和细毛樟的叶片精油得率普遍低于黄樟和香樟，这是因为猴樟和细毛樟叶片相对大而厚且革质化程度高，叶片中精油的游离释放难度大，精油不能被充分提取。细毛樟和黄樟叶片精油中柠檬醛相对含量较香樟和猴樟更高，这可能与细毛樟和黄樟分布地地理环境有关，相对较高的气温有利于次生代谢产物的形成和积累。不同省(自治区)柠檬醛型樟组植物叶精油得率和柠檬醛相对含量受植物自身与环境条件的综合影响，如四川广元的猴樟，由于受该种类叶片特性影响，叶片精油得率普遍偏低，受高海拔和低气温等因子影响，次生代谢产物的合成受限，柠檬醛相对含量普遍偏低。同省(自治区)同种类不同个体间的精油得率和柠檬醛相对含量也存在差异，这可能是因为不同种类的树龄[17]、坡向[18]和坡位[19]等因子直接影响次生代谢产物的合成，也可能是因为土壤、肥力和林分密度[20-23]等影响植株长势及光照强度[24]等，导致精油合成及柠檬醛积累受到间接影响。

本研究将叶片精油得率高于1.35%和柠檬醛相对含量高于47.62%的样株确定为初选优株，共选出14株初选优株；在此基础上，根据选优指标(λ)大于121.01进行二次筛选，最终选出8株优良单株，包括1株一级优良单株、1株三级优良单株和6株四级优良单株，其中，一级优良单株的精油得率为3.64%，柠檬醛相对含量为51.12%。筛选的8株优良单株包括2株香樟和6株黄樟，各占相应种类样株数的三分之一。就目前的提取工艺而言，香樟和黄樟是柠檬醛型樟组植物优良单株筛选的理想种类。猴樟中编号NM-36和NM-42的样株柠檬醛相对含量分别高达77.00%和77.13%，明显高于其余样株，但二者的叶片精油得率均低于叶片精油得率的均值，不满足初选优株叶片精油得率和柠檬醛相对含量均高于均值的标准，因此，这2株样株未能入选初选优株。

为了排除外界环境因子的影响，建议在后续实验中将精油得率及柠檬醛相对含量在一至三级的样株在相同立地条件下进行比较分析。