基于网络药理学的耳聋左慈丸治疗耳聋耳鸣作用机制研究△

蒲玉红 朱仁愿 刘兴国 程世红 丁辉 焦娜 崔啸

耳聋左慈丸是中医治疗耳聋耳鸣的经典名方，收录于2015年版《中国药典》中，处方组成包括：磁石(煅)、熟地黄、山茱萸(制)、牡丹皮、山药、茯苓、泽泻和竹叶柴胡等8味中药；具有滋肾平肝之功效，用于肝肾阴虚，耳鸣耳聋，头晕目眩[1]。研究证实，耳聋左慈丸对药物性聋[2]、突发性聋[3]、老年性聋[4，5]、耳鸣[6]、神经性耳鸣[7]、中耳炎[8]等疾病均疗效确切。近年来，随着分子生物学的发展，耳聋左慈丸的疗效研究已经进入细胞层面[9，10]。网络药理学是融合了系统药理学、计算系统生物学、统计分析学等多学科的大数据技术，通过对化学成分、靶点、作用途径的研究实现药物作用的综合网络分析，已被广泛用于中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述[11]。本研究通过网络药理学方法对耳聋左慈丸治疗耳聋耳鸣药效作用进行了初步分析，为进一步深入探讨其作用机制提供参考。

1 资料与方法

1.1数据库的选取及软件 中药系统药理学数据库与分析平台TCMSP(http://tcmspw.com)；UniProt蛋白数据库(http://www.uniprot.org)；Cytoscape3.6.1软件；Gene在线数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)；STRING11.0在线软件(https://string-db.org)；David6.8在线数据库(https://david.ncifcrf.gov/)。

1.2耳聋左慈丸活性成分的筛选 采用TCMSP平台，以耳聋左慈丸处方组成中的各味药为关键词检索其含有的所有化学成分。然后根据药物的药物动力学(ADME)特性[即吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)、排泄(excretion)]中的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(druglikeness，DL)筛选出可能的活性化合物[12]。

1.3化合物-靶点网络的构建 通过TCMSP平台检索1.2中筛选出的活性化合物相关的潜在靶点，将得到的靶点名称输入UniProt蛋白数据库，设定物种为人，通过UniprotKB搜索功能得到人的蛋白质基因名称。将活性化合物和相关靶点信息导入Cytoscape 3.6.1软件，从而构建出耳聋左慈丸的化合物-靶点网络图。

1.4耳聋耳鸣疾病靶蛋白蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络的构建 通过Gene在线数据库，以“耳聋(deafness)”、“耳鸣(tinnitus)”为关键词检索相关基因。为进一步研究耳聋左慈丸靶点与耳聋耳鸣疾病靶点在蛋白水平上的互相作用关系，选取两者交集的靶点蛋白输入到STRING11.0在线软件，物种设定为人，置信度设置为0.400，获取蛋白相互作用信息，得到 PPI 网络结构图。将PPI数据导入Cytoscape 3.6.1软件进行分析。

1.5基因本体(gene ontology，GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes andgenomes，KEGG)通路富集分析，构建化合物-靶点-通路网路 将经PPI网络结构图筛选出的交集蛋白上传至David 6.8在线数据库功能进行GO富集和KEGG富集分析。采用 Cytoscape 3.6.1软件将交集蛋白、与其相关联的化合物及富集分析得到的信号通路构建化合物-靶点-信号通路网络图。

2 结果

2.1活性化合物及靶点的筛选 通过TCMSP平台搜索耳聋左慈丸处方组成中各药味含有的化合物，以OB≥30%，DL≥0.15为筛选条件[13]，经去重复后筛选出活性化合物87个；继而检索每个活性化合物对应的相关靶点，结果显示有55个化合物分别作用于235个靶点，其中32个化合物没有相关靶点信息(表1)。

表1 87个活性化合物的分子编号、名称、来源、口服生物利用度、类药性及靶点数

2.2化合物-靶点网络 利用Cytoscape3.6.1软件构建得到化合物-靶点网络见图1。网络中交集290个节点和660条边，耳聋左慈丸中共筛选出87个活性化合物，其中有32个化合物未找到相应靶点，没有参与网络的构建，所以290个节点分别为55个化合物节点(用绿色圆形表示)和235个靶点节点(以蓝色菱形表示)。边表示化合物与靶点之间的相互关系，耳聋左慈丸中每个活性化合物平均作用于12(660/55)个靶点，每个靶点平均所连接药物的数量是2.81(660/235)，由此可以看出耳聋左慈丸是以多途径、多靶点协同的方式发挥治疗作用的。

图1 化合物-靶点网络

网络的拓扑学性质能够反映化合物-靶点的相互关系，一个节点所连接的线条个数称之为度(degree)，度较大的节点在整个网络中起到枢纽的作用，可能是关键的化合物或者靶点[14]。利用Cytoscape 3.6.1软件中的Network Analyzer功能分析耳聋左慈丸化合物-靶点的度值，可以得出化合物中度排名前3位的化合物是槲皮素(quercetin，M98)、山奈酚(kaempferol，M422)和β-谷甾醇(Beta-sitosterol，M358)，分别能与154、63、39个靶点蛋白发生相互作用；靶点中度排名前3位的是核受体辅激活因子2(NCOA2)、前列腺素G/H合成酶2(PTGS2)和前列腺素G/H合成酶1(PTGS1)，分别能与28、26、18个化合物发生相互作用。

2.3耳聋耳鸣疾病PPI网络 在Gene在线数据库分别以“deafnes”、“tinnitus”为关键词检索到相关蛋白353个，经筛选得出37个与耳聋左慈丸作用靶点交集的蛋白(表2)。将37个交集蛋白上传至STRING 11.0在线软件中，构建耳聋耳鸣疾病PPI网络(图2)，其中8个蛋白(DCAF17、GSTP1、MTO1、SLC12A7、SLC19A2、SLC22A4、SLC44A4、SLC52A2)无相互作用关系。导出STRING数据，采用Cytoscape 3.6.1软件进行分析可知，网络中包括29个存在相互作用的蛋白节点和96条边，degree值排名前列的蛋白节点有CALM1、COL4A3、COL2A1、COL11A2和GJA1，degree值均为7。

图2 PPI网络

表2 37个与耳聋左慈丸作用靶点交集的蛋白信息

2.4GO富集与KEGG通路富集 采用Davidv 6.8在线数据库对PPI网络中筛选的29个潜在靶点进行GO富集和KEGG富集。

GO富集是对PPI网络中的靶点蛋白在基因功能中的作用进行研究，根据错误发生率(false dis-covery rate，FDR)<0.05分析得到365个GO条目，表3列出前20条，其中与生物过程(biological process，BP)相关的条目11个，涉及听觉、心率调节、心肌收缩调节、离子跨膜转运调节、系统过程调节等方面；分子功能(molecular function，MF)相关的条目有2个，涉及细胞外间质结构组成和结构分子活性；细胞组成(cellular component，CC)相关的条目有7个，涉及胶原三聚体、内质网腔和闰盘等。

表3 PPI网络中的GO条目前20条的类别、编号、名称、基因数及错误发生率(错误发生率<0.05)

KEGG富集主要是研究靶点蛋白在信号通路中的作用，根据FDR<0.05分析，得到26个与耳聋耳鸣疾病有关的KEGG条目，包括糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、FAS信号通路(focal adhesion)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、细胞外基质-受体相互作用信号通路(ECM-receptor interaction)等(表4)，这些信号通路可能与耳聋耳鸣病理过程密切相关。

表4 PPI网络中26个与耳聋耳鸣相关的KEGG条目编号、名称、基因数及错误发生率(错误发生率<0.05)

2.5化合物-靶点-信号通路网络 利用Cytoscape3.6.1软件构建化合物-靶点-信号通路网络(图3)，图中包括耳聋左慈丸化合物18个(以黄色三角形表示)，耳聋耳鸣疾病相关靶点20个(以橙色正六边形表示)，信号通路26个(以紫色正方形表示)。根据degree值分析该网络得出：化合物中，排名前3的是槲皮素、茵陈黄酮(areapillin，M4609)和山酮C(hancinone C，M5430)，来自于牡丹皮、柴胡和山药；相关靶点中，处于前列的为钙调蛋白1(CALM1)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素6(IL6)和酪氨酸蛋白磷酸酶非受体Ⅱ型(PTPN11)；主要集中的信号通路有糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway indiabetic complications)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、胰岛素抵抗(insulin resistance)、抗叶酸(antifolate resistance)、神经营养蛋白信号通路(neurotrophin signaling pathway)等。表明耳聋左慈丸的多种活性化合物通过作用于多个相关靶点，实现调节多条信号通路的目的，继而调控耳聋耳鸣病理过程的不同环节，最终发挥治疗作用，这与中药治疗疾病的系统性和整体性的特点相符合。

图3 化合物-靶点-信号通路网络

3 讨论

本研究利用TCMSP平台检索并筛选得到耳聋左慈丸中有87种活性化合物，其中55种化合物分别作用于235个靶点。利用Gene在线数据库检索到耳聋耳鸣疾病相关蛋白353个，将其与耳聋左慈丸的235个化合物靶点蛋白交集后得到耳聋左慈丸治疗耳聋耳鸣作用靶点37个。将37个交集蛋白上传至STRING11.0在线软件中，构建PPI网络，网络显示8个蛋白无相互作用关系。对其余29个交集蛋白进行GO富集和KEGG信号通路富集。GO富集分析发现，耳聋左慈丸基因功能主要体现在听觉、心率调节、心肌收缩调节、离子跨膜转运调节、系统过程调节、细胞外间质结构组成、结构分子活性、胶原三聚体、内质网腔和闰盘等方面。KEGG通路筛选得到26个与耳聋耳鸣疾病有关的条目，包括糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、FAS信号通路、PI3K-Akt信号通路、细胞外基质-受体相互作用信号通路等。构建化合物-靶点-信号通路网络，结果显示，耳聋左慈丸中有18个活性化合物与治疗耳聋耳鸣疾病的20个靶点蛋白存在较强的相互作用，这些靶点主要集中于26条信号通路。

化合物-靶点-信号通路网络中，化合物包括槲皮素、茵陈黄酮、海风藤酮(kadsurenone，M322)、豆甾醇(stigmasterol，M449)、β-谷甾醇(beta-sitosterol，M358)、常春藤皂苷元(hederagenin，M296)、山奈酚(kaempferol，M422)、异鼠李素(isorhamnetin，M354)、黄芩苷(Baicalin，M2776)、羟基芫花素(Hydroxygenkwanin，M5530)等18种。研究显示，老年性聋、突发性聋、糖尿病性聋等耳聋耳鸣疾病的发病与血粘度异常、血脂异常、动脉硬化、糖尿病并发症等存在相关性[15～18]；耳聋左慈丸的18种活性化合物中黄酮类成分槲皮素、茵陈黄酮、海风藤酮、常春藤皂苷元、山奈酚、异鼠李素和黄芩苷具有显著抗氧化、清除自由基、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗血栓、降糖、降压、降血脂、免疫调节、心血管保护、神经保护等药理作用和生物活性[19～26]，植物甾醇类成分β-谷甾醇和豆甾醇也具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节、降胆固醇和中枢神经系统作用等[27，28]，表明耳聋左慈丸可能通过这18种活性化合物发挥治疗耳聋耳鸣的作用。

陈学敏等[29]研究发现，强噪声刺激会导致耳蜗内耳毛细胞钙离子平衡失调，造成钙超载从而损伤听觉传入神经功能，而钙离子通道阻滞剂可抑制噪声引起的耳蜗毛细胞和听觉系统的损伤。翟建光等[30]通过探究血清炎性因子及耳蜗组织神经营养因子对老年性聋大鼠的影响发现，老年性聋与耳蜗组织中的TNF-α、IL-1β、IL-6、sVCAM-1、VE-cadherin、HMGB1、NGF蛋白、NT-3蛋白、钙蛋白酶及钙蛋白酶mRNA均有密切关联，其在老年大鼠耳蜗中的异常表达，对老年性聋的诊断、治疗及预后有重要意义。许晖雁等[31]则发现PTPN11基因突变与听力下降之间存在基因型-表型相关性，生殖细胞PTPN11基因突变可导致Noonan综合征和多痣Noonan综合征，两症患者听力下降，多数表现为传导性聋，多伴发分泌性中耳炎，亦有表现为感音神经性聋、混合性聋。本研究结果显示与耳聋耳鸣疾病相关的20个靶点中，处于前列的有CALM1、TNF、IL6和PTPN11，因此，推断耳聋左慈丸中的活性化合物可能是通过作用于关键的靶点CALM1、TNF、IL6和PTPN11发挥治疗作用。

研究显示，AGE-RAGE信号通路在机体衰老过程中激活NF-κB活性使其转位胞核中，继而诱导产生多种损伤因子，如IL-1β、TNF-α等，调节细胞周期抑制蛋白，导致耳蜗神经细胞的坏死及血管缩窄，最终使听力下降[32]。PI3K-Akt信号通路的激活，可增加衰老神经细胞的抗氧化功能，增加线粒体碱基切除修复酶的表达，维持线粒体的生物合成功能，减少氧化应激损害及抑制调亡反应的发生，干预中枢性老年性聋的发生[33]；而胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)是导致2型糖尿病发病的主要生理病理机制，长期IR将严重损伤PI3K/Akt信号级联通路，导致下游靶点表达紊乱，进而破坏能量代谢稳态，并诱发蛋白过度磷酸化，造成糖尿病性听力下降[34]。敖华飞等[35]研究发现叶酸缺失形成的高同型半胱氨酸血症可能是全聋型突发性聋的一个危险因素。陈菲等[36]采用糖皮质激素联合注射用鼠神经生长因子治疗突发性聋，疗效显著，可能是因为鼠神经生长因子可以抑制耳蜗毛细胞、螺旋神经节细胞的凋亡缺失及血管纹的退化变性变薄，对年龄相关性聋和突发性聋具有保护作用；周爽等[37]通过研究胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在耳鸣大鼠模型下丘中的表达及作用机制发现，耳鸣大鼠下丘GDNF及其受体RET、P-PI3K p85α、P-AKT蛋白水平低于健康对照组，表明GDNF对耳鸣有抑制作用。本研究显示耳聋耳鸣疾病相关生物学信号通路有26条，由此预测，耳聋左慈丸中多种化合物通过作用于多个靶点、调控26条生物学信号通路，从而达到治疗耳聋耳鸣的作用。

综上所述，本研究从网络药理学角度，初步阐述了耳聋左慈丸治疗耳聋耳鸣疾病的活性成分、潜在靶点及发挥药效的关键生物学信号通路，为进一步深入研究其药理作用机制提供了参考。