吡菲尼酮对UUO大鼠肾组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路表达的影响

杨松 康晓明 孟庆云 杨舒贺 陈卫红 韩宇鹏 梅梅 聂晶 杨丽微 周晓昭

(佳木斯大学附属第一医院 1儿内一科，黑龙江 佳木斯 154003;2消化一科；3佳木斯中心医院儿科；4佳木斯大学研究生院)

各种慢性肾脏疾病(CKD)进行性发展的最终后果是肾脏纤维化(RIF)〔1〕。RIF的特征在于肾实质细胞的损伤及细胞外基质(ECM)的异常沉积及上皮细胞-间质转分化(EMT)〔2〕。肾小管间质纤维化(TIF)是过度合成和ECM分解减少之间不平衡的结果，这可能是由于正常修复基质失调，炎症反应不受控制和成肌纤维细胞增殖所致〔3〕。RIF也可被认为是TIF，因为该过程具有肾小管破坏的特征。TIF会加速受损肾的变性，并干扰邻近的健康肾小管，从而促进纤维化发展〔4〕。关于RIF进展的现有知识极其复杂，因此难以预防甚至消除。目前尚无有效的方法来预防RIF的发展。吡非尼酮〔5甲基1苯基2-(1H)吡啶酮〕是一种口服生物可利用的人工合成分子，为白色或淡黄色结晶性粉末，研究发现其对纤维化过程中的重要促纤维化因子及氧化-应激通路、抗氧化通路均有一定的调节作用，能抑制成纤维细胞增殖和胶原合成，减少细胞和组织纤维化标志物的产生〔5〕。吡非尼酮参与多种纤维化疾病的病理过程，在肿瘤、眼底及肠道纤维化、肺脏纤维化、RIF方面已表现出其临床应用的价值〔6～9〕。目前国内外关于吡菲尼酮影响肾间质纤维化组织中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路之间关系的研究较少，本文探讨吡菲尼酮与PI3K/Akt/mTOR信号通路的关系，探究吡菲尼酮在肾间质纤维化进程中可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1.1动物分组 由佳木斯大学动物实验中心饲养，雄性Wistar大鼠90只，体重(150±10)g，适应性饲养1 w，按照随机数字法分为假手术组、UUO组，实验治疗组各30只。

1.2动物模型 除假手术组外，其他各组无菌条件下行左侧输尿管结扎术：术前器械消毒，大鼠称重后用10%水合氯醛0.3～0.4 ml/100 g腹腔内注射麻醉，备皮，常规消毒，在大鼠背部，左侧肋腰点下约0.5 cm、脊柱左侧约1.0 cm做一纵向切口，1.5～2.0 cm长，逐层进腹，充分暴露肾脏，用小弯镊轻轻分离出输尿管，用“0”号丝线分别在紧靠肾盂处及远离肾盂约1 cm处结扎输尿管，在两结中间剪断输尿管，用一代头孢类药物及生理盐水冲洗腹腔后，逐层缝合腹膜腔各层及背部皮肤，覆盖无菌纱布。假手术组除不结扎、不剪断输尿管外，其余所有处理同上。

1.3实验方法 健康大鼠制成UUO模型，实验治疗组给予吡菲尼酮200 mg/(kg·d)灌胃，假手术组和UUO组给予等量生理盐水灌胃，1次/d。各组分别在手术后第3，7，14天分别处死10只大鼠。留取左侧梗阻肾标本，梗阻肾沿矢状面用手术剪小心剖开，肾组织在4%多聚甲醛中固定24 h，待做苏木素-伊红(HE)染色及免疫组化等。

1.3.1HE染色 将石蜡包埋的肾组织制成4 μm厚切片，行HE染色观察，低倍镜下单盲依序观察5个肾小管间质视野，按肾间质损伤8项指标评分：肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管扩张、肾小管萎缩、红细胞管型、蛋白管型、间质水肿、间质纤维化、间质细胞浸润，计算其均值，作为该标本的肾小管间质损伤指数。

1.3.2免疫组化 所有肾组织按常规固定、脱水、透明、石蜡包埋，切片4 μm。肾细胞PI3K、Akt、mTOR蛋白表达部位染色呈棕黄色，每例切片随机观察10个连续不重叠的200倍视野，计算阳性染色面积与视野内肾小管间质面积(除去肾小管管腔) 的比值，取平均值为每只大鼠的检测值。

1.4统计学方法 采用SPSS23．0统计软件进行方差分析、t检验。

2 结 果

2.1各组不同时间点TIF比较 镜下观察，假手术组不同时间点小管结构无明显异常，UUO组术后第3天HE染色结构显示肾小管轻度扩张，上皮细胞轻度水肿，间质见少量炎性细胞浸润；术后第7天可见管腔扩张明显，且数量增多，部分扩张管腔可见少许脱落的上皮细胞及蛋白管型，间质炎性细胞浸润明显；术后第14天可见肾脏皮髓质层明显萎缩，肾小管管腔严重变形(扩张、塌陷、萎缩)，上皮细胞变性、坏死、脱落较重，大量炎性细胞浸润。与UUO组对应时间点相比，实验治疗组肾组织损伤程度明显减轻(P<0.05)。见表1、图1。

表1 3组术后不同时间点TIF比较分,n=10)

2.2各组PI3K、Akt、mTOR蛋白表达 假手术组肾小管内PI3K、Akt、mTOR表达较少；UUO组PI3K、Akt、mTOR表达较假手术组增加明显，且随梗阻时间的延长表达量明显增加(P<0．05)；与UUO组相比，实验治疗组相应时间PI3K、Akt、mTOR表达明显减少，且显著高于假手术组(P<0.05) 。见表2。

图1 各组术后不同时间点肾组织变化(HE，×400)

表2 各组术后不同时间点PI3K、Akt、mTOR蛋白表达

3 讨 论

PI3Ks是磷酸化磷脂酰肌醇，是真核细胞膜的组成部分之一〔10〕,在广泛的细胞过程中起着重要作用，包括运动性和细胞周期进程，并与氧化应激有关，高糖微环境导致活性氧过度产生，使PI3K和Akt 磷酸化比率增加，从而导致 EMT〔11〕。PIP3可与Akt的PH区结合，使Akt发生转位现象，从细胞质转移到细胞膜上，促进其构象改变。PI3K/Akt信号通路可通过调控DNA甲基转移酶磷酸化水平来调节其DNA甲基化，也可调控组蛋白甲基转移酶的甲基化、磷酸化和乙酰化水平，从而调节组蛋白甲基化来调控其生物活性〔12〕。

Akt包含3个结构域：根据丝氨酸/苏氨酸残基的差异，Akt分为3种同种型，PI3K激活Akt1上苏氨酸激动磷酸化过程，随后磷酸化在羧基末端调节结构域，其由PI3K依赖性机制启动，完全激活Akt〔13〕。mTOR是众所周知的Akt磷酸化靶点，特异性结合具有GTP酶活化蛋白(GAP)活性的Rheb GTP酶，其直接激活mTORC1〔14〕。Meier等〔15〕通过实验证实雷公藤内酯可通过PI3K/Akt信号通路影响miR-188-5p和磷酸酶基因(PTEN)之间的相互作用改善肾间质纤维化的EMT过程，改善预后。在正常细胞中，PI3K/Akt途径是细胞代谢、增殖、分化和存活的中枢信号调节因子。该途径在多种疾病中经常失调，包括实体瘤、免疫介导的疾病和特发性肺纤维化，是一个有吸引力的治疗纤维化疾病的靶标〔16〕。该途径被细胞表面受体激活，例如酪氨酸激酶受体，其激活PI3K的p110亚基。催化磷脂酰肌醇4，5-二磷酸(PIP2)转化为PIP3激活Akt。Akt向几种下游效应子发出信号，包括mTOR、叉头转录因子(Fox蛋白)和Bcl-2抗凋亡蛋白。虽然PI3K/Akt/mTOR途径的转导过程逐渐出现在研究者的视线中，但是蛋白激酶相互作用是复杂的反馈回路〔17，18〕。mTOR参与了大量其他细胞过程，包括代谢、炎症、细胞凋亡和衰老。因此mTOR在调节许多疾病，包括纤维化和癌症中发挥中心作用〔19，20〕。

PI3K/Akt/mTOR依赖性途径是与多种细胞生理代谢存活高度相关的因子途径〔21〕。该途径在多种疾病中表现出活跃的调节功能，参与多种细胞反应过程〔22〕。mTOR激酶通常被称为该途径的主要调节物。mTOR引起可干预基质的异常沉积及细胞转分化进程，mTOR抑制剂是有希望的纤维增生性疾病调节剂〔23〕，mTOR逐渐成为纤维化性疾病的研究新热点。mTORC1作为对于雷帕霉素高度敏感的靶蛋白，控制着细胞生长和代谢〔24〕。Akt活化抑制结节性硬化综合征基因(TSC)1和TSC2，其通过富集在组织中的GTP结合蛋白Ras同源物(Rheb)间接激活mTOR激酶活性〔25〕。由于mTOR的作用由上游PI3K/Akt信号调控，在各种生理及病理性疾病过程发挥作用。PI3K依赖性通路激活通过mTORC1依赖性4E-BP1/真核翻译起始因子(EIF)4E信号传导导致胶原蛋白Ⅰ表达增加，发挥调节纤维化的作用。并且mTORC1主要在压力环境中调节细胞生长和自噬，这会改变成纤维细胞的增殖和活力。由于Ⅰ型胶原细胞相互作用在肺纤维化的进展中起关键作用，因此异常的mTORC1调节在许多慢性纤维增生性疾病中至关重要〔26〕。

吡非尼酮已被证明可减轻RIF，但是其具体的作用机制仍需要进一步探究。吡非尼酮治疗5 w导致菊粉清除率的显著改善，而未治疗的对照组肾功能没有任何恢复。染色结果发现吡非尼酮治疗5 w后的肾脏组织学也显示出纤维化病变的明显减弱〔27〕。Rad等〔28〕在局部节段性肾小球硬化(FSGS)的单独模型中，吡非尼酮在给药3个月后肾小球硬化程度明显减轻。mTOR似乎在增加各种类型成纤维细胞的增殖中起重要作用。有研究发现mTOR促进了瘢痕成纤维细胞(KF)的增殖。由于PI3K/Akt/mTOR信号传导是ATP诱导的外膜成纤维细胞增殖所必需的，证明mTOR对调节成纤维细胞增殖至关重要。由于转化生长因子(TGF)-β的作用是纤维化过程的核心并与mTORC1和mTORC2都有关，因此合理的治疗可能需要考虑mTOR和TGF-β的双重抑制。mTOR抑制可改变病理性成纤维细胞中的PI3K信号传导，而TGF-β受抑制可使Akt活化和EMT最小化，因此减少肌成纤维细胞的转化〔29〕。

综上，吡菲尼酮对终末期肾脏功能的调节作用，是通过影响PI3K/Akt/mTOR 信号通路表达实现的。