血尿清胶囊对IgA肾病模型大鼠肾组织中MMP-9及TIMP-1表达的影响

金迪 张守琳 邹迪

(1长春中医药大学，吉林 长春 130117；2长春中医药大学附属医院)

IgA肾病(IgAN)占国内外原发性肾小球疾病的43.45%，发病率最高〔1〕，以IgA、IgG免疫复合物沉积在肾小球系膜区为特点。IgAN最初被认为是良性原发性肾小球疾病，但越来越多的临床研究数据表明，在确诊后的20～30年里将有30%～40%的IgAN患者发展至终末期肾脏病(ESRD)〔2〕。血尿清胶囊是长春中医药大学附属医院院内制剂，具有滋阴补肾、清热利湿、凉血止血的作用。临床应用近20年，取得了显著效果，本研究旨在探讨血尿清胶囊治疗IgAN的疗效及作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 选择6～8周龄，SPF级雄性SD大鼠，共80只，体重(180±20) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供〔许可证号SCXK(京)2016-0006〕。

1.2实验仪器、试剂及药物 全自动尿液分析仪URIT-1500购自上海三葳医疗设备有限公司；荧光素标记兔抗大鼠IgA抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；四氯化碳(CCl4)购自北京化学试剂厂；电子秤TD10002A购自余姚市金诺仪器有限公司；牛血清白蛋白(BSA)、脂多糖(LPS)购自美国Sigma公司；基质金属蛋白酶(MMP)-9酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂盒、金属蛋白酶抑制因子(TIMP)-1 ELISA检测试剂盒(批号20180620A，规格96T/盒)购自美国RD公司；血尿清胶囊(墨旱莲、车前草、小蓟、蒲黄、三七)，批号：20180608，由长春中医药大学附属医院中医药研究中心制备提供；肾炎康复片(国药准字Z10940034)购自天津同仁堂集团股份有限公司。

1.3实验方法

1.3.1造模方法 参照陆慧渝等〔3〕报道的方法制备IgAN动物模型；将BSA以蒸馏水配成100 g/L的浓度，从实验第1天开始以BSA 400 mg/kg(4 ml/kg)灌胃，隔日1次，共8 w；皮下注射CCl4 0.1 ml+蓖麻油0.3 ml，1次/w，共9 w；于第6周尾静脉注射LPS 0.05 mg/只(以0.9%NaCl配成溶液0.25 g/L，0.2 ml/只)。第9周各组随机选取2只大鼠，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠取肾组织，经苏木素-伊红染色(HE)及免疫组化观察证实IgA造模是否成功。

1.3.2分组及给药 第9周验证IgAN大鼠模型成功后，将大鼠随机分成模型组、血尿清胶囊高、中、低剂量组、肾炎康复片组。第10～16周给予药物治疗给予空白组和模型组每只大鼠2 ml/(kg·d)生理盐水灌胃；血尿清胶囊高、中、低剂量组分别给予血尿清胶囊2 ml/(kg·d)灌胃〔相当于生药量0.648 g/(kg·d)、0.324 g/(kg·d)、0.162 g/(kg·d)〕；对照组给予肾炎康复片2 ml/(kg·d)灌胃〔相当于生药量0.648 g/(kg·d)〕。疗程共8 w。

1.3.3观测指标 观察大鼠治疗前后的一般状态，检测治疗前后各时相尿红细胞计数(RBC)、24 h尿蛋白定量(UTP)及治疗后肾组织中MMP-9、TIMP-1含量。

1.3.4标本收集方法 将大鼠于0、4、6、8、10、12、14、16 w末放于代谢笼中收集24 h尿液，观察尿液颜色变化，记录尿量，应用磺基柳酸法检测UTP；应用尿沉渣计数法测定尿RBC；给予药物治疗结束后，处死大鼠，取肾脏，采用ELISA(具体详见试剂盒说明)检测肾组织中MMP-9、TIMP-1含量。

1.4统计学方法 采用SPSS19.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1一般情况 实验过程中，空白组死亡2只，模型组死亡6只。空白组大鼠始终状态良好，第6周开始造模组大鼠出现食欲差，乏力嗜睡倦怠，毛色晦暗，尿色加深，体重下降。给药后，血尿清胶囊高、中、低剂量组和肾炎康复片组大鼠症状开始好转。

2.2大鼠各时相尿RBC水平比较 空白组大鼠尿检正常，其余各组大鼠自第6周开始尿RBC升高，自第10周起，各治疗组大鼠尿RBC明显较模型组下降(P<0.05)，血尿清胶囊中剂量组明显优于肾炎康复片组(P<0.05)，见表1。

表1 大鼠各时相尿RBC水平比较个/HP)

2.3大鼠各时相UTP水平比较 空白组大鼠尿检正常，其余各组大鼠自第6周开始UTP升高，自第10周起各治疗组大鼠UTP明显较模型组下降(P<0.05)，血尿清胶囊中剂量组明显优于肾炎康复片组(P<0.05)，见表2。

2.4各组肾组织中MMP-9、TIMP-1水平比较 与空白组比较，模型组大鼠MMP-9水平明显下降，TIMP-1水平明显上升，MMP-9/TIMP-1比值明显降低(均P<0.05)；与模型组比较，各治疗组MMP-9水平明显上升，TIMP-1水平明显下降，MMP-9/TIMP-1比值明显上升，以血尿清胶囊中剂量组变化更为明显(均P<0.05),且明显优于肾炎康复片组(P<0.05)。见表3。

表2 大鼠各时相UTP水平比较

表3 各组肾组织中MMP-9，TIMP-1水平比较

3 讨 论

IgAN以血尿、蛋白尿为主要临床表现。对于肾小球源性血尿合并蛋白尿>1.0 g/d以上者，现代医学以肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)阻断剂、激素联合免疫抑制剂为主治疗，而对于单纯性血尿尚无有效的治疗方法。中医药治疗血尿，较之西药治疗有独特的优势，临床疗效较好、副作用小，不仅能控制血尿，同时能有效改善患者的腰痛、乏力等临床症状。“尿血”“溺血”是血尿在中医里的名称。多半以上的医生认为引起血尿病因病理主要是湿热，故多以清热利湿、凉血止血为主要治病原则。但血尿极易反复发作，病情缠绵难愈，其根本原因在于“久病多虚”“久病多瘀”，慢性肾炎患者由于长期血尿伤及肾脏，不仅存在“下焦湿热”，同时还存在肾阴亏虚、瘀血阻络的病理机制，由于单纯注重清热凉血以治其标，而忽略了滋阴补肾扶其本，造成血尿反复经久不愈。血尿清胶囊是长春中医药大学附属医院老中医经过多年临床经验总结研制而成，历经20年的临床应用，疗效显著，能够有效降低血尿及蛋白尿。早莲草能凉血止血，同时入肝肾二经，具有滋补肝肾，固本培元，使水旺则火自熄的作用，为君药；小蓟能清下焦热，有止血、散瘀解毒的功效；栀子苦寒，清热泻火，除烦利湿，凉血以止血，二者共为臣药，既能助君药凉血止血，同时还能破瘀生新，保精养血，使止血而不留瘀；佐使药为蒲黄、三七、车前草，有化瘀凉血止血的作用；诸药合用，攻补兼施，共奏滋阴补肾以扶正，清热凉血止血，化瘀通络的作用，使止血而不留瘀。

IgAN的发病往往是由多种原因共同作用的结果。目前研究发现，细胞外基质(ECM)降解酶系统紊乱，会引起ECM积聚导致进行性肾小球硬化(GS)和间质纤维化(TIF)，最终进入ESRD〔4，5〕。而MMP-9是调节ECM的最重要的酶〔6，7〕，TIMP-1是一种主要抑制肾脏ECM降解导致GS的酶〔8～10〕。TIMP-1与 MMP-9以1∶1形成MMP-TIMP复合物，阻断MMP-9与底物结合，从而影响ECM积聚和降解平衡〔11，12〕,TIMP-1/MMP-9任何两者间的比例失衡都可能使ECM异常聚积，引发肾小球疾病，导致肾小球结构重塑，血尿和蛋白尿形成。因此维持 MMPs/TIMPs系统平衡显得非常重要。

本研究结果表明血尿清胶囊能够降低血尿和蛋白尿，而MMP-9、TIMP-1的异常表达参与了IgAN的发病机制，血尿清胶囊通过调节MMP-9/TIMP-1的平衡从而达到治疗IgAN的目的。