DEAD盒多肽43小干扰RNA对司美替尼抑制人肺腺癌A549细胞增殖和诱导其凋亡作用的影响

崔 黎，崔 莹，赵 娜，陈奎生

(1．郑州大学第一附属医院病理科，河南 郑州 450052；2.郑州卫生健康职业学院病理教研室，河南 郑州 450199；3.郑州市中心医院病理科，河南 郑州 450007)

非小细胞肺癌约占肺癌的80%[1]，在我国发病率近年来也是逐年攀升，且非小细胞肺癌中以肺腺癌最为多见[2]。目前，临床上早期肺腺癌的治疗仍是传统的手术切除、放疗、化疗和近年来新兴的靶向治疗，而中晚期肺腺癌患者主要治疗方法仍是化疗。临床治疗实践发现，应用含铂类药物进行化疗是针对中晚期肺腺癌患者唯一支持疗法，部分患者疗效差，虽患者的总生存期有不同程度增加，但上限最多是20%反应率和(或)中位生存期8～10个月[3]，肿瘤细胞生长快、强侵袭性和(或)出现耐药是其主要原因。目前的靶向药物都是针对肺腺癌K-RAS未突变的患者，尚无针对K-RAS突变肺腺癌的靶向治疗药物。DEAD盒多肽43(DEAD box polypeptide 43，DDX43)首次发现于人横纹肌肉瘤LB23-SAR细胞株中，DDX43基因位于染色体6q12～13，由648个氨基酸构成，全长2 300 bp，定位于细胞质[4]。研究[5]揭示，在K-RAS信号通路的调节中DDX43基因起到重要作用，且高表达于多种实体肿瘤中。小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)作为一种重要的基因表达调控因子近年逐渐被发现和认识，其可以选择性剔除或关闭某个基因的表达[6-7]。其过程是指定目标基因，利用转染技术将siRNA导入靶细胞内，从而敲弱目标基因。因此，该技术可用于已知序列的基因标定或沉默，是研究目标药物和(或)基因功能的重要方法和技术手段。研究[8]证实，DDX43基因在众多实体肿瘤中高表达，且与肿瘤细胞恶性增殖、肿瘤免疫和化疗药物耐药有重要关系。本研究通过细胞免疫组化、原位杂交、MTT及TUNEL方法分别对各组人肺腺癌A549细胞进行研究，探讨DDX43 siRNA对司美替尼抑制A549细胞增殖和诱导其凋亡作用的影响，为肺腺癌患者寻找理想靶向药物提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞株来源A549细胞株由河南省肿瘤病理重点实验室馈赠。

1.2 主要试剂兔抗人DDX43多克隆抗体，购自河南天驰生物科技有限公司；司美替尼购自郑州科邦生物科技有限公司；TUNEL试剂盒购自上海罗氏有限公司。

1.3 实验分组及处理对照组：A549细胞未做任何处理；司美替尼组：10 μmol/L司美替尼处理A549细胞12 h；司美替尼+DDX43 siRNA组：DDX43 siRNA载体转染A549细胞24 h后，再用10 μmol/L司美替尼处理A549细胞12 h。

1.4 实验方法

1.4.1 转染 1)常规培养A549细胞，接种于六孔板，当细胞覆盖率达70%时进行转染；2)41 μL纯化DDX43 siRNA溶入无血清、抗生素的400 μL培养基，获得A液；3)制取B液：4 μL脂质体加入400 μL无血清、抗生素的培养基；4)混匀A液、B液，室温静置30 min；5) 无血清RPMI-1640培养基洗涤A549细胞2遍，然后加入上一步骤的混合液，37 ℃培养温箱中培养；6)分组收集培养的A549细胞，便于后续实验使用。

1.4.2 细胞免疫组化法检测A549细胞中DDX43蛋白表达 按照说明书步骤进行操作，滴加浓度为1100一抗(兔抗人DDX43多克隆抗体)50 μL，新鲜配制DAB液进行显色反应，控制显色时间，自来水中止显色反应，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)替代一抗作为阴性对照，用已证实的DDX43蛋白阳性表达的食管癌组织切片作为阳性对照。DDX43蛋白阳性表达信号呈棕黄色细颗状，定位于细胞质中，采采用分析软件定量分析其相对表达量。

1.4.3 原位杂交法检测A549细胞中DDX43 mRNA表达 1)取出备用的A549细胞爬片，常温放置l h后，PBS洗涤3次，每次5 min；2)浸泡细胞爬片于冰浴质量分数0.3% TtitonX-100溶液中，放置0.5 h，PBS洗涤3次，每次5 min；3)滴加体积分数3%过氧化氢去离子水于备用细胞爬片上，室温静置0.5 h，再用灭菌蒸馏水洗涤细胞爬片3次，以到达灭活内源性过氧化物酶的目的；4)暴露mRNA核酸片段：1 mL质量分数3%柠檬酸混匀浓缩型2滴胃蛋白酶(注：现配现用)滴加在备用爬片上，室温环境消化20 min，PBS洗涤3次，每次5 min，灭菌蒸馏水洗涤1次；5)继续滴加质量分数1%多聚甲醛，室温下静置10 min，用灭菌蒸馏水洗涤爬片3次；6)预杂交：密闭湿盒内，滴加20 μL预杂交液于备用爬片上，42 ℃温箱预杂交2～4 h；7)杂交：湿盒内继续滴加含有探针的杂交液20 μL，轻柔盖上蜡膜，放置于42 ℃温箱12～16 h；8)杂交后处理：在42 ℃条件下，0.1×柠檬酸盐杂交液洗涤细胞爬片，洗脱非特异性杂交4次，每次15 min；9)杂交后显色。RNase酶0.1 mg/mL降解实验爬片的mRNA后，用无探针杂交液孵育作为阴性对照，用已知的DDX43 mRNA阳性食管癌组织作阳性对照。DDX43 mRNA阳性定位于胞质内，呈现紫蓝色颗粒，采用图像分析软件定量分析其相对表达量。

1.4.4 MTT比色法检测A549细胞增殖情况 取A549细胞进行分组处理；每孔中加入20 μL 5 μg/mL的MTT溶液，培养箱内继续培养4 h，加入二甲亚砜150 μL，震荡约10 min；酶标仪测量各孔波长为492 nm，细胞生长抑制率=(1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。

1.4.5 TUNEL法检测A549细胞凋亡情况 按照试剂盒步骤操作，加入500 μL TUNEL反应液，用现配的DAB溶液50 μL进行显色反应，自来水中止显色，并控制显色时间。TUNEL计数凋亡的细胞核和凋亡小体，两者均呈棕褐色，细胞核无着色为阴性细胞。计数凋亡细胞数方法是随机任选10个高倍视野，计数200个细胞，凋亡指数=(凋亡细胞数/200)×100%。

2 结果

2.1 各组DDX43蛋白相对表达量比较对照组、司美替尼组、司美替尼+DDX43 siRNA组DDX43蛋白相对表达量分别为138.20±17.72、79.95±8.96、36.16±6.31，总体比较差异有统计学意义(F=66.72，P=0.02)；表达水平依次降低，且两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图1。

图1 各组DDX43蛋白相对表达量比较(×200)

2.2 各组DDX43 mRNA相对表达量比较对照组、司美替尼组、司美替尼+DDX43 siRNA组DDX43 mRNA相对表达量分别为266.20±15.07、164.95±8.96、71.16±6.31，总体比较差异有统计学意义(F=125.35，P=0.01)；表达水平依次降低，且两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图2。

2.3 各组A549细胞凋亡指数比较对照组、司美替尼组、司美替尼+DDX43 siRNA组A549细胞凋亡指数分别为(3.75±0.55)%、(11.72±1.06)%、(19.98±1.21)%，总体比较差异有统计学意义(F=12.37，P=0.04)；凋亡指数依次升高，且两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见图3。

图2 各组DDX43 mRNA相对表达量比较(×200)

图3 各组A549细胞凋亡指数比较

2.4 各组A549细胞生长抑制率比较对照组、司美替尼组、司美替尼+DDX43 siRNA组A549细胞生长抑制率分别为(2.11±0.13)%、(14.91±0.29)%、(27.14±0.58)%，总体比较差异有统计学意义(F=15.23，P=0.03)；生长抑制率依次升高，且两两比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。

3 讨论

DDX43在多种常见实体瘤中都有表达，但DDX43表达程度在不同实体瘤中有所差异，乳腺癌和膀胱癌组织中DDX43蛋白低表达，弥漫星形细胞瘤组织中中等强度表达，食管鳞癌、胃腺癌、恶性黑色素瘤、肝细胞癌及前列腺癌组织中均高表达[4,9-10]。研究[11]显示，在多种淋巴造血肿瘤中DDX43 mRNA呈高表达。Abdel-Fatah等[12]通过对乳腺癌患者的追踪研究发现，DDX43可作为预测患者对化疗药物反应的指标之一，也是乳腺癌患者不良预后因素参考指标。多项研究[13-14]表明，DDX43下调可以促使该细胞群中的N-RAS蛋白表达下降，而其下游MEK和ERK信号通路的活性也显著受抑。从而推测DDX43可以调控N-RAS蛋白表达，因此，可以通过上调RAS表达从而达到介导A549细胞对MEK抑制剂司美替尼的耐药。

A549细胞中RAS低表达，在司美替尼耐药细胞中DDX43高表达，增强RAS蛋白活性和表达、蛋白激酶B及ERK都会显著升高。在A549细胞转染DDX43可以诱导RAS蛋白表达，进而赋予细胞对司美替尼的耐药表型，而利用DDX43 siRNA沉默DDX43同时也可以对司美替尼起到增敏作用。

本研究结果证实，DDX43 siRNA转染后的A549细胞中DDX43蛋白和mRNA的表达均呈下降趋势，且DDX43 siRNA联合司美替尼可抑制A549细胞增殖，促进其凋亡，这为临床治疗肺腺癌和增强肺腺癌化疗敏感性奠定理论基础。