一株类NADC30猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及遗传变异分析

王景隆，全东群，莫清荣，冯建远，王 豪，曾 悦，任同伟，王玉旭，陈 樱，欧阳康，黄伟坚，韦祖樟

（1.广西大学动物科学技术学院 动物传染病与分子免疫学实验室，南宁 530005；2.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，南宁 530005）

猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一种能够使怀孕母猪流产、死胎以及仔猪、育肥猪生长缓慢、呼吸系统出现损伤为主要特征的高度接触性传染病[1-2]。该病于1987年在美国首次被发现，主要临床表现为母猪繁殖障碍和新生仔猪的呼吸道疾病，随后全世界范围内相继暴发该病[3]。PRRSV是一种单股正链不分节段的RNA病毒，其基因组包括至少10个开放阅读框，即ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7[4-6]。根据基因组核苷酸序列及抗原性差异，将PRRSV分为两种不同的类型，即PRRSV1和PRRSV2[7]。2008年，美国学者分离到了1株在Nsp2的高变区有着131（111+1+19）个氨基酸的不连续缺失的毒株，将其命名为NADC30。2012年起，与NADC30具有相似性的PRRSV变异毒株（NADC30-like）在我国大部分地区流行[8]。有研究表明，目前正在广泛使用的商业化疫苗对NADC30-like病毒株仅能提供有限的免疫保护作用，而自然重组使得该病在临床上的防治更加困难[9-10]。本研究对广西某猪场采集到疑似PRRSV的肺脏组织进行检测，结果为阳性。随后利用PAM细胞从病料组织中成功分离出1株PRRSV毒株，并对其进行鉴定分析，为广西地区的PRRSV防控提供了借鉴意义。

1 材料与方法

1.1 病料及处理 病料样品为广西某猪场采集到疑似PRRSV的肺脏组织，剪碎研磨处理后用于病毒RNA的提取。

1.2 主要试剂TaqMix、RNase酶抑制剂、dNTP Mixture、M-MLV购自TaKaRa公司；MEM、新生胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibco公司；PAM细胞由本实验室保存。

1.3 引物信息 参照已发表的NADC30的全基因组序列，分别设计了3对特异性引物，用于对GP5和Nsp2的扩增。引物由上海杰李生物技术有限公司合成，见表1。

表1 本研究中使用的PRRSV扩增引物Table 1 Primers for PRRSV amplification in this study

1.4 毒株分离及鉴定

1.4.1 PRRSV鉴定 取制研磨好的病料上清液，按照试剂盒说明书提取病毒RNA，用随机引物反转录制备cDNA。以N1/N2为引物进行PCR检测，反应程序：94℃预变性2 min；94℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32个循环；72℃延伸10 min。经琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测。

1.4.2 病毒的分离 取阳性病料的组织研磨液，3000×g离心10 min后用0.22 μL的滤器过滤获取病毒液。PAM细胞经复苏后培养于6孔板中，待完全贴壁时，弃去培养基，用300 μL两倍稀释的混合病毒液接种生长良好的细胞，在37℃的CO2培养箱孵育1 h，弃去上清液，每孔加入2 mL含2%胎牛血清的MEM培养基培养2～4 d，逐日观察细胞病变（cytopathic effect，CPE)。当有80%的细胞出现CPE时收获上清液，取300 μL病毒液再连续传3代。将收获的细胞病毒液进行RNA抽提和RT-PCR检测，方法同1.4.1。同时利用针对PRRSV N蛋白的特异性单克隆抗体进行间接免疫荧光的特异性实验。

1.5 ORF5和部分Nsp2基因的扩增 取已鉴定为阳性的PRRSV GXNN1839株P3代细胞毒提取RNA。用随机引物42℃反转录1 h制备cDNA于-20℃存放备用。用ORF5-F/ORF5-R和Nsp2-F/Nsp2-R为引物分别进行PCR反应。反应程序为：94℃预变性3 min；98℃变性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共32个循环；72℃再延伸10 min。

1.6 ORF5和部分Nsp2基因序列分析 对目的条带进行胶回收，克隆成功后送测序。利用生物学软件Lasergene、Mega6.0等对获得的序列进行分析。

2 结果

2.1 PRRSV的检测 经RT-PCR检测，该肺脏组织为PRRSV阳性，扩增出的目的条带在443 bp左右（图1），与预期大小一致。

图1 PRRSV RT-PCR检测Fig.1 Detection of PRRSV by RT-PCR

2.2 病毒分离培养及鉴定 将过滤好的病料接种PAM细胞，36 h后开始出现CPE，48 h后可看到细胞皱缩、聚堆、脱落等（图2）。收毒后进行IFA实验，结果显示，接毒的PAM细胞有特异的红色荧光出现（图3A），而未接毒的阴性细胞中没有荧光（图3B）。由此，鉴定所分离到的病毒为PRRSV。

图2 PRRSV分离株在PAM细胞上的CPEFig.2 CPE of PAM cells infected with PRRSV isolates

图3 间接免疫荧光检测PRRSV分离株Fig.3 Detection of PRRSV isolate in PAM by indirect immuno fluorescence assay

2.4 GP5基因的克隆和同源性分析 使用GP5基因的特异性引物对GXNN1839进行PCR扩增，目的条带大小与预期一致（图4）。测序结果显示，该毒株的GP5基因与GenBank上GP5基因的参考序列的同源性为62.0%～93.7%（图5），与北美病毒株NADC30的同源性最高，为93.1%，与我国分离的NADC30-like病毒株CHsx1401的同源性为91.7%，与VR-2332、CH-1a的同源性分别是87%、86.7%，与高致病性病毒株JXA1的同源性为86.7%，与欧洲株Lelystadvirus（LV）同源性为62.0%。

图4 PRRSV分离株ORF5基因的PCR扩增Fig.4 Amplification of ORF5 gene of PRRSV isolate by PCR

图5 GP5核苷酸序列的同源性分析Fig.5 Homology analysis of GP5 nucleotide sequences

2.5 GP5基因的遗传进化分析 将GXNN1839的GP5基因序列与参考毒株的序列对比，使用Mega6.0软件构建遗传进化树（图6），由结果可知，PRRSV毒株分为欧洲型和美洲型，其中美洲型PRRSV又主要分为4个谱系（Lineage 1、Lineage 3、Lineage 5和Lineage 8）。该遗传进化树表明，GXNN1839与美国毒株NADC30以及中国的NADC30-like毒株同属于Lineage 1，证明该毒株属于NADC30-like亚群。2.6 Nsp2基因的扩增及氨基酸对比分析 由于Nsp2蛋白编码区是PRRSV中变异最大的区域，为了探讨Nsp2的遗传变异规律，我们针对Nsp2的高变区进行了测序分析。将测序结果拼接后，利用MegAlign软件与参考毒株的氨基酸序列进行了对比。结果显示，与VR-2332相比，该毒株的Nsp2高变区共缺失131（111+1+19）个氨基酸（图7），与2008年美国分离到的NADC30毒株和我国分离的类NADC30（CHsx1401）毒株具有相似的缺失特征，进一步表明GXNN1839属于类NADC30。

图6 GXNN1839 GP5核苷酸序列与参考株序列的遗传进化树Fig.6 Phylogenetic tree based on GP5 nucleotide sequences of GXNN1839 and reference strains

图7 NSP2基因的氨基酸序列比对分析Fig.7 Comparison of amino acid sequences of NSP2 gene

3 讨论

PRRS是世界养猪业中的重大传染病之一，其迅速变异和演化加剧了该病预防和控制难度。2006年，高致病性PRRSV（HP-PRRSV）在中国猪场暴发并引起大规模的死亡[11]。2013年，周峰等[12]分离到了1株Nsp2区与NADC30毒株Nsp2区具有相同缺失特征的毒株，命名为NADC30-like。后来，许多学者也通过Marc-145细胞和PAMs分离到了该病毒。邓跃等[13]通过PAM分离到了NADC30-like，并通过IFA验证了病毒的存在。对病毒进行体外分离是研究和防治该病毒的前提，而在体外培养时，PRRSV仅能感染猪肺泡巨噬细胞（PAMs）和源于MA-104的几个亚细胞系（Marc-145、CL2621、HS.2H）。由于PAMs难以获得且为原代细胞，所以一般情况下，优先使用Marc-145细胞对PRRSV进行体外分离。自2013年我国分离到类NADC30以来，目前该毒株已成为我国NADC30-like当前PRRSV优势流行病毒株之一。

NADC30-like易发生重组，Zhang等[14]对13株NADC30-like的全基因组分析，发现有10株属于重组毒株，且重组断裂点多发生在编码Nsp的基因中。在本次研究中，我们对广西某发病猪场采集到的病料进行了RT-PCR检测，结果呈PRRSV阳性。将病料样品接种在PAM细胞上进行病毒的分离，第一代时就出现典型的PRRSV细胞病变（CPE），IFA也验证N蛋白在细胞中的表达。对毒株的GP5及Nsp2进行序列分析，结果表明，该分离毒株的GP5基因在遗传进化树上与美国毒株NADC30处于同一分支，并且与其同源性最高；Nsp2序列对比表明，该区域有131（111+1+19）个氨基酸缺失，进一步表明GXNN1839为类NADC30 PRRSV。

近年来，NADC30-like在我国的大面积流行形成了PRRSV毒株多样化的局面，其变异速度快、易重组的特性造成了该病的防治困难，临床上正在使用的商业化疫苗对该类毒株缺乏有效的免疫保护作用。本研究丰富了PRRSV的基因组信息，为研究在我国流行的类NADC30毒株的特性和致病机制奠定了基础，为广西地区的PRRSV防控和该毒株疫苗的研制提供一定的数据支持。