急性冠状动脉综合征患者PCI术后受体相互作用蛋白激酶1表达及其与支架内再狭窄的关系

刘小希， 邹 文， 孟刘坤， 宋 民

经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）是 急 性 冠 状 动 脉 综 合 征（acute coronary syndrome，ACS）的主要治疗方法之一，可有效改善动脉粥样硬化斑块堵塞血管引发的心肌缺血、缺氧［1-3］。近年来PCI术后支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR）备受关注。文献报道显示普通金属支架ISR发生率为15%～30%，即使是药物洗脱支架，ISR发生率也高达10%［4］。寻找预示ISR的相关指标，对患者预后改善有重要意义。然而目前临床中缺乏灵敏度和特异度均较高的指标预示ISR。受体相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1是一种细胞膜上死亡受体家族触发的细胞应答上游调节蛋白，在细胞凋亡、坏死性凋亡、炎性反应和细胞表型转换中发挥重要作用［5］。有研究显示RIPK1与血管平滑肌细胞表型转换关系密切，可通过核因子（NF）-κB途径参与血管平滑肌细胞表型转换，进而促进ISR［6］。血管平滑肌细胞经收缩表型转换成合成表型过程可促进其增殖、迁移和分泌等增强，促进ISR发生和发展［7］。本研究检测PIPK1表达水平，探究其与PCI术后ISR的关系，以期为预防和治疗ISR提供帮助。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选择2017年4月至2019年6月在北京阜外医院接受PCI治疗的188例ACS患者作为研究对象，根据《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》［8］诊断ACS。纳入标准：①首次诊断为ACS；②配合完成相关检查；③PCI术后1年内主诉疑似心绞痛不适症状，接受冠状动脉造影检查；④签署知情同意书。排除标准：①既往有ACS病史；②接受PCI外其他治疗；③伴有慢性阻塞性肺疾病、高同型半胱氨酸血症、下肢动脉硬化闭塞症、恶性肿瘤等；④有心肌病、心瓣膜病史；⑤PCI术后不规律服用抗血小板聚集、调节糖脂代谢等药物；⑥临床资料不完整。188例ACS患者中男141例，女47例，年龄45～77（63.12±6.44）岁；ST段抬高型心肌梗死（ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI）134例，非ST段抬高型心肌梗死（non-ST elevation myocardial infarction，NSTEMI）45例，不稳定心绞痛（unstable angina，UA）9例。根据PCI术后1年是否发生ISR将患者分为ISR组（n=51）和非ISR组（n=137）。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 信息收集

收集ACS患者年龄、性别、体质量指数（body mass index，BMI）、吸烟史、ACS类型、糖尿病史、高血压史、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、总胆固 醇（total cholesterol，TC）、三 酰 甘 油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、收缩压（systolic blood pressure，SBP）、舒张压（diastolic blood pressure，DBP）、血管病变位置、血管病变长度、血管病变支数及支架直径等信息。

1.3 RIPK1表达水平检测

抽取ACS患者PCI术前、术后7 d空腹外周静脉血10 mL，Ficoll密度梯度离心法［9］获取外周血中单个核细胞。蛋白质免疫印迹法［10］检测单个核细胞中RIPK1表达水平。放射免疫沉淀法（RIPA）裂解单个核细胞，分离出总蛋白，二辛可酸（BCA）蛋白浓度测定试剂盒定量。10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳（80～120 V）至溴酚蓝跑出胶面，转膜（300 mA），5%脱脂奶粉室温封闭2 h。分别滴加兔抗人RIPK1单克隆抗体、兔抗人β-肌动蛋白（actin）抗体（上海群己生物科技公司），4℃孵育过夜；滴加山羊抗兔二抗（上海群己生物科技公司），室温下孵育2 h。电化学发光（electrochemiluminescence，ELC）液显影。Image J软件计算RIPK1相对表达水平。

1.4 ISR检查

所有ACS患者均于PCI术后1年复查冠状动脉造影，观察左前斜、右前斜及头脚轴状位投影，评估左主干、左前降支、左回旋支和右冠状动脉狭窄程度。定量冠状动脉造影（QCA）分析软件（CASS，荷兰Pie Medical Imaging公司）对造影图像进行定量分析。ISR定义为支架内和/或支架两端5 mm内管腔狭窄率≥50%。

1.5统计学方法

采用R3.6.3软件进行数据分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组间比较用独立样本t检验，组内比较用配对样本t检验。计数资料以例（n）表示，组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）评价RIPK1诊断ACS患者ISR的效能。限制性立方样条拟合logistic回归法分析RIPK1与ACS患者ISR的关系。

2 结果

2.1 两组基线资料比较

两组间患者年龄、性别、BMI、吸烟史、糖尿病史、高血压史、SBP、DBP、TC、TG、HDL-C、ACS类型、血管病变位置和支架直径差异均无统计学意义（P＞0.05）。ISR组FBG、LDL-C、3支血管病变占比和血管病变长度均高于非ISR组，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 两组RIPK1表达水平比较

非ISR组、ISR组PCI术前RIPK1表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），术后RIPK1表达水平均降低，且非ISR组低于ISR组，差异有统计学意义（P＜0.05）。非ISR组PCI术前、术后RIPK1降低程度（△RIPK1）高于ISR组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2、图1。

2.3 RIPK1评估ISR的价值

PCI术前、术后RIPK1诊断ISR的ROC曲线下面积、最佳截断点、灵敏度、特异度分别为0.528（95%CI：0.454～0.601）、0.84、25.49%、85.40%，0.868（95%CI：0.812～0.913）、0.50、78.43%、84.67%；△RIPK1诊断ISR的ROC曲线下面积、最佳截断点、灵敏度、特异度分别为0.736（95%CI：0.667～0.797）、0.28、78.43%、61.31%。PCI术后RIPK1诊断ISR的效能高于术前RIPK1和△RIPK1，差异均有显著统计学意义（Z=6.284、3.729，P＜0.001），见图2。

2.4 影响ACS患者ISR的因素分析

将ACS患者PCI术后1年内是否发生ISR作为因变量，FBG、LDL-C、血管病变支数、术后RIPK1和血管病变长度作为自变量，纳入多因素logistic回归分析，结果显示FBG、血管病变支数、术后RIPK1和血管病变长度均为ACS患者PCI术后1年内ISR的独立危险因素（P＜0.05），见表3。

表1 两组基线资料比较

表2 两组RIPK1表达水平比较 %

图1 两组RIPK1表达的蛋白质免疫印迹图

2.5 RIPK1与ISR的关系

用限制性立方样条拟合logistic回归法分析RIPK1与ISR的关系，节点个数为3时Akaike信息准则（AIC）值最小（AIC=153.010），显示RIPK1与ISR有关（χ2=37.14，P＜0.001），呈线性关系（非线性检验χ2=1.41，P=0.235）。将PCI术后RIPK1诊断ISR的最佳截断点作为参考点，RIPK1＜0.50时，PCI术后1年内ISR发生风险降低；RIPK1＞0.50时，PCI术后1年内ISR发生风险增加，见图3。

图2 RIPK1诊断ISR的ROC曲线

表3 影响ACS患者ISR的因素分析

图3 RIPK1与ISR限制性立方样条图

3 讨论

外周血单个核细胞与ACS发病及进展关系密切，其可通过黏附、活化血管内皮细胞释放白细胞介素-1β、C反应蛋白等炎性介质，促进ACS发病及进展［11］。本研究推测RIPK1通过调节血管平滑肌细胞表型转换参与PCI术后ISR发生和发展过程，因此检测外周血单个核细胞中RIPK1表达水平，探究其与ISR关系，有助于预防ISR，降低死亡率。本研究中ACS患者ISR发生率为27.1%，高于既往文献报道的ISR发生率，推测原因可能在于受试者均于主诉疑似心绞痛不适症状后接受冠状动脉血管造影检查，ISR发生率偏高。本研究结果显示PCI术后ISR组和非ISR组RIPK1表达水平均降低，而非ISR组低于ISR组，且非ISR组△RIPK1高于ISR组；提示RIPK1可能与ISR有关，其表达水平或可预测ISR发生情况。

本研究构建RIPK1诊断PCI术后1年内ISR的ROC曲线，结果显示PCI术后RIPK1诊断ISR的ROC曲线下面积、灵敏度、特异度分别为0.868、78.43%、84.67%，诊断效能高于术前RIPK1和△RIPK1；表明PCI术后RIPK1评价术后1年内ISR的效能较高，但灵敏度偏低，尚可辅助评价ISR。

既往研究表明ISR危险因素较多。阎志等［12］研究显示高血压史、糖尿病史、LDL-C高于1.8 mmol/L、多支病变、支架位于左前降支、支架直径＜3 mm，支架长度＞20 mm，均为冠心病患者PCI术后ISR的独立危险因素。Cheng等［13］研究显示糖尿病史和支架长度是PCI术后1年内ISR的独立危险因素。Wu等［14］研究显示2型糖尿病、支架长度和支架直径与PCI术后ISR有关。此外，钟继明等［15］研究显示伴糖尿病、伴高血压、吸烟史、植入支架长度和支架直径均为ISR的独立相关因素。本研究采用多因素logistic回归法分析影响ACS患者PCI术后1年内ISR的危险因素，结果显示FBG、血管病变支数、PCI术后RIPK1和血管病变长度均为ACS患者PCI术后1年内ISR的独立危险因素，而糖尿病史、高血压史、吸烟史、支架直径、病变位置和LDL-C等与PCI术后1年内ISR无关。本研究结果与上述研究结果存在一定差异，可能与纳入研究样本量、地域等有关，后续需开展多中心大样本研究验证本研究结论。

包勤学等［6］研究显示血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞中RIPK1表达水平升高，血管平滑肌细胞表型转换加快；抑制RIPK1表达可降低NF-κB的p65亚基磷酸化水平，同时血管平滑肌细胞表型转换、增殖、迁移及分泌均受到一定程度抑制。本研究结果还显示PCI术后RIPK1与ISR有关，且呈线性关系；RIPK1＜0.50时PCI术后1年内ISR发生风险降低，RIPK1＞0.50时术后1年内ISR发生风险增加，推测原因在于外周血单个核细胞中RIPK1可通过促进NF-κB的p65亚基磷酸化诱导收缩表型的血管平滑肌细胞向合成表型的血管平滑肌细胞转化，促进血管平滑肌细胞增殖、迁移及分泌，加速ISR发病和进展。

综上所述，RIPK1与ACS患者PCI术后1年内ISR有关，检测其表达水平有助于预判PCI术后1年内ISR发生情况。RIPK1高表达水平提示PCI术后1年内发生ISR风险高。本研究为单中心研究，样本量偏小，后续将开展多中心大样本研究验证本研究结论。