基于ISSR分子标记的白术遗传多样性分析

蒋小刚， 王 华， 周武先， 张美德

(湖北省农业科学院中药材研究所， 湖北 恩施 445000)

白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz.)为菊科苍术属多年生草本植物，原产地为浙江、安徽，现已在浙江、安徽、河北、湖南、湖北等地普遍种植[1]，白术以根茎入药，挥发油是主要药效成分，其中含有苍术醇、苍术酮、白术内酯等药用成分[2-4]，具有健脾益气，燥湿利水，止汗安胎的功效[5]。

白术栽培历史悠久，长期不同产区及居群的引种和杂交现象导致白术出现种质混杂、市场药材质量参差不齐等问题[6]，因此研究白术的遗传多样性和亲缘关系对白术种质鉴定、分类和良种选育至关重要。已有学者开展了对不同产区的白术的遗传多样性研究，孙靓等[6]采用ISSR分子标记技术对浙江、安徽、河北、山西四个省白术主产区的的15个居群进行遗传多样性分析，发现白术具有较高的遗传多样性，不同居群白术亲缘关系与产区无明显相关性。而刘逸慧等[7]的研究结果却不同，通过对浙江、贵州、福建、湖北4个省白术主产区的7个居群的ISSR遗传多样性研究，发现同一主产区不同居群亲缘关系相近，不同产区白术存在遗传分化现象。雷美艳等[8]首次通过ITS2条形码技术分析了安徽、浙江、重庆、河南、湖北等7个不同产地白术的遗传多样性，发现各产地白术具有多种单倍型，且具有特异单倍型。也有学者对单一产区的不同品系白术进行遗传多样性分析。郑建树等[9]通过对大盘山自然保护区的11个白术品系进行ISSR聚类分析，结果表明，各品系之问都发生了遗传分化，形成了遗传差异，这将为白术优良品系筛选奠定基础。

本研究采用ISSR分子标记技术对浙江、安徽、河北、湖北、湖南、重庆等6个白术主产区的17份种质资源进行遗传多样性分析，探讨不同产地白术的遗传多样性及遗传分化水平，将为白术种质资源鉴定、保存利用、良种选育等提供参考价值。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料来源于白术种质资源圃，每个产地随机选取3株白术的幼嫩叶片混成1份样品，共采集17份样品，产地信息见表1。

表1 17份白术种质的产地信息

1.2 基因组DNA提取及检测

采用北京天根生物科技有限公司的新型植物DNA提取试剂盒提取白术幼嫩叶片基因组DNA，用超微量核酸蛋白测定仪和琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和纯度，保存于-20 ℃备用。

1.3 ISSR多态性引物筛选及扩增

ISSR引物由上海英俊公司合成，选取B 1(重庆酉阳)和B 8(河北安国县-2)两个白术产地的模板DNA，基于优化的白术ISSR反应体系筛选出9条多态性ISSR引物，优化的ISSR扩增体系为：模板DNA 1 μL(50 ng)，2×Taqmaster mix 10 μL，引物2 μL(5 μmoL)，ddH2O 7 μL。反应程序为：94 ℃ 预变性5 min，然后94 ℃变性0.75 min，52 ℃退火0.75 min，72 ℃延伸1.5 min，共40个循环，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 数据处理

在琼脂糖凝胶电泳胶图上同一水平位置的有条带记为1，无条带记为0，采用Excel 2007软件对数据进行整理，采用Popgene 1.32软件计算遗传特征指标：观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s 基因多样性指数(He)和Shannon’s信息指数(I)，用NTSYS-pc 2.10软件计算遗传相似系数(GS)、遗传距离(GD)，并用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取与检测

由图1可知，提取的17份白术基因组DNA条带清晰明亮、无拖尾。用中药材条形码ITS2对提取的白术基因组DNA进行扩增，结果表明，17份白术基因组DNA都能扩增出500 bp左右的片段，且条带明亮单一(图2)，表明提取的白术基因组DNA质量高，可用于后续白术的ISSR分析。

2.2 ISSR引物扩增多态性

基于优化的白术ISSR-PCR体系，从100条ISSR引物中筛选出9条多态性引物用于白术遗传多样性分析。由表2可知，9条引物扩增总条带数为768，其中多态性条带数为545，平均多态性条带百分率为72%；扩增总位点数为73，其中多态性位点数为59，平均多态性位点百分率为88%。各引物多态性位点百分率都在50%以上，其中引物UBC 834、UBC 841、UBC 846的多态性位点百分率最高，均为100%。引物UBC 846多态性条带数和多态性位点数都最多，分别为113和12，图3电泳结果显示，引物UBC 846对17份白术种质扩增条带差异明显、条带清晰，表明筛选的多态性引物适用于白术遗传多样性分析，以上结果表明，17份白术种质资源具有丰富的遗传信息。

表2 多态性ISSR引物扩增结果

注： M为DL 2000 DNA Marker；1～17为17份白术种质编号。

注：M为SuperDNA Marker；1～17为17份白术种质编号。

2.3 遗传特性分析

用Popgene 1.32软件对17份白术种质进行遗传特性分析。结果表明，白术种质的平均等位基因(Na)为1.808 2，平均有效等位基因数(Ne)为1.401 1，平均Nei’s基因多样性指数(He)为0.246 9，平均Shannon信息指数(I)为0.380 8，表明17份白术种质遗传多样性水平较高。

2.4 遗传相似性和遗传距离分析

采用NTSYS-pc 2.10软件分析17份白术种质的遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD)。由表3可知，各种质间GS值在0.589～0.904之间，平均值为0.727，变幅为0.315；各种质间GD值在0.084～0.425之间，平均值为0.245，变幅为0.341。其中种质B 3和B 17间的GS最大，而GD值最小，分别为0.904和0.084，表明B 3和B 17种质间的遗传相似性最高，亲缘关系最近；B 5和B 14间的GS最小，而GD值最大，分别为0.589和0.425，表明B 5和B 14种质间的遗传相似性最低，亲缘关系最远。

2.5 聚类分析

采用NTSYS-pc 2.10软件UPGMA聚类法对17份白术种质资源进行系统聚类(图4)，遗传系数范围为0.67～0.90，平均值为0.73，从上至下可将白术种质聚类为四组，第一组为B 1，第二组可分为两个亚组，第一亚组包括B 2、B 3、B 17、B 13、B 16，第二亚组包括B 6、B 7、B 10、B 11，第三组为B 4，第四组包括B 9、B 14、B 15，种质B 12、B 5、B 8分别聚为一组。以上结果表明各产地白术存在明显遗传分化，具有丰富的遗传多样性。

3 讨 论

研究不同产地白术的遗传多样性对于白术种质资源鉴定分类、保护利用、良种选育等具有重要参考价值。ISSR分子标记是基于微卫星序列开发出的新型分子标记，相比传统的分子标记，具有多态性丰富、标记数量多、易检测、成本低等优势[10-11]，已广泛应用于种质资源鉴定、指纹图谱、基因定位、系统进化等方面研究[12-13]。

表3 17份白术种质遗传相似系数和遗传距离

注：M为DL 2000 DNA Marker；1～17为17份白术种质编号。

本研究基于筛选的9条多态性ISSR引物从17份白术资源的基因组DNA中扩增出768条条带，其中多态性条带数为545，平均多态性条带百分率为72%。此外，遗传特征指标如平均Nei’s基因多样性指数(He)为0.246 9，平均Shannon信息指数(I)为0.380 8，表明白术的遗传多样性水平较高，这与孙靓等[6]的研究结果一致。种质资源间的亲缘关系是种质创新利用和优良品种选育的基础[12]。遗传相似性(GS)和遗传距离(GD)分析发现，B 3(湖南省平江县-2)和B 17(浙术1号)种质间的遗传相似性最高，亲缘关系最近，浙术1号为选育的白术优良品种[14]，可见B 3种质在遗传特性上与浙术1号最为相似，这为B 3产地的优良品种选育提供依据。系统聚类发现，B 2(湖南省平江县)和B 3(湖南省平江县-2)，B 7(河北省安国县)和B 10(河北省安国县-4)，B 14(浙江省新昌县回山乡)和B 15(浙江省嵊州市谷来镇)分别聚为一类，表明地理分布与亲缘关系具有一定相关性[15]，而部分地理分布较近的产地却没有聚在一起，比如安徽省亳州市谯城区的3个产地B 11、B 12和B 13并未聚为一类，而是分散在各聚类组中，表明部分产地白术没有产生明显的地域性差异，这与孙靓等[6]的研究结果一致。此外，B 1(重庆市酉阳县)、B 12(安徽省亳州市谯城区-2)、B 5(湖北省咸丰县小村乡)、B 8(河北省安国县-2)分别聚为一组，可见白术资源遗传差异较大，遗传信息丰富，这将为白术优势单株筛选，杂交亲本选配及进一步的良种选育提供一定基础。

注：B 1～B 17种质编号见表1。

本研究对17份不同产地的白术种质资源进行了遗传多样性分析，在分子水平上可为白术种质资源分类提供参考，同时为白术新品种选育提供科学依据。