非小细胞肺癌组织中活化蛋白-1、多瘤促活化因子表达对患者预后的影响

王 齐,周向东,韩 忠,刘 畅

(海南医学院第一附属医院 呼吸内科,海南 海口,570000)

肺癌是临床常见恶性肿瘤之一，发病率和病死率在世界范围内均较高，其中非小细胞肺癌(NSCLC)约占肺癌总数的80%[1]。虽然近年来NSCLC的临床诊疗技术已取得较大进展，但由于该病早期症状缺乏特异性，绝大多数患者确诊时已处于肺癌中晚期，主要采用化疗为主的综合治疗模式进行治疗，5年生存率较低，因此寻找能够早期诊断和预后评估的指标非常重要[2]。活化蛋白-1(AP-1)是由Fos蛋白和Jun蛋白等多种蛋白组成的同源或异源二聚体，通过亮氨酸拉链与DNA结合[3]。研究[4-5]发现,AP-1参与细胞增殖、分化和凋亡等过程，与癌症等多种疾病的发生有关。多瘤促活化因子(PEA3)属于Ets家族PEA3亚家族的重要成员，参与哺乳动物细胞、组织、器官的生长发育过程，在多种肿瘤细胞的增殖分化过程中具有重要作用[6]。本研究探讨了NSCLC患者肿瘤组织中AP-1、PEA3表达水平对预后的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2013年7月—2015年2月本院收治的75例NSCLC患者肺癌组织及距癌组织>5 cm处的癌旁组织石蜡标本。NSCLC患者纳入标准:① 经组织病理学诊断确诊为NSCLC者;② 一般资料完整且同时具有癌组织和癌旁组织标本者;③自愿配合调查研究及远期随访，并能完成临床记录者。排除标准:① 妊娠期妇女;② 意识不清或精神障碍无自主生活能力者;③ 合并其他恶性肿瘤者;④ 合并严重心、肾功能障碍者;⑤合并其他传染性疾病者。本组患者年龄31～79岁，平均(60.25±10.58)岁;男43例，女32例;病理组织学分型为鳞癌41例，腺癌34例;肿瘤直径≥3 cm者49例,<3 cm者26例;TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期35例,Ⅲ～Ⅳ期40例;淋巴结转移者49例，无转移者26例;分化程度为中、低分化43例，高分化32例;胸膜转移者28例，无转移者47例。本研究经过医院医学伦理委员会审核批准。

1.2 常用试剂及仪器

二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(批号P0010S,上海碧云天有限公司);兔源c-Jun抗体(货号ab40766，美国Abcam公司)，鼠源PEA3抗体[货号sc-166629,圣克鲁斯生物技术(上海)有限公司]，甘油醛三磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(货号AM4300,美国英杰生命技术有限公司)，二抗羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)、羊抗兔IgG(货号分别为B-2752、15135,美国英杰生命技术有限公司);日本Olympus IX73倒置荧光显微镜等。

1.3 方法

1.3.1 AP-1、PEA3蛋白表达检测:采用免疫组化法(SP)检测AP-1磷酸化活化蛋白c-Jun[7]、PEA3蛋白表达。将石蜡标本连续切片，脱蜡至水，抗原修复，添加兔抗人c-Jun(1∶200)和鼠抗人PEA3(1∶100),4 ℃孵育过夜，添加二抗羊抗兔(鼠)IgG,DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，脱水，透明，封片。

1.3.2 结果判定:细胞核或细胞浆内出现棕色颗粒为阳性。采用免疫反应积分(IRS)法进行评分:染色强度(SI)积分，无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别记为0、1、2、3分;阳性染色细胞百分比(PP)<1%记0分,1%～<11%记1分,11%～<51%记2分,51%～<76%记3分,76%～100%记4分。IRS=SI×PP,IRS≥3分为阳性,IRS<3分为阴性。2名资深病理医师按双盲法对结果进行半定量评分。

1.3.3 随访:对出院后NSCLC患者进行电话随访或门诊随访，每月1次，随访时间5年，以5年内患者死亡为预后不良，生存为预后良好。以患者死亡日期或2019年2月28日为随访截止日期。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件分析数据，计数资料以[n(%)]描述，比较行χ2检验。采用Kaplan-Meier生存曲线分析NSCLC患者癌组织AP-1、PEA3蛋白表达与预后的关系，采用Cox回归分析方法分析NSCLC患者不良预后的危险因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 癌组织与癌旁组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况比较

肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达率均高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05),见表1、图1。

表1 NSCLC患者癌组织及癌旁组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况比较[n(%)]

2.2 肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况与NSCLC患者临床病理参数及一般资料的关系

NSCLC患者肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达与患者吸烟史、分化程度、TNM分期、淋巴结转移及胸膜转移情况有关(P<0.05),见表2。

表2 肺癌组织AP-1、PEA3蛋白表达情况与NSCLC临床病理参数及一般资料的关系[n(%)]

2.3 肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况与NSCLC患者预后的关系

NSCLC患者5年总生存率为34.67%,AP-1蛋白阳性表达组、PEA3蛋白阳性表达组的5年总生存率为12.50%、15.15%,分别低于AP-1蛋白阴性表达组、PEA3蛋白阴性表达组的51.11%、50.00%,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

A: AP-1蛋白表达情况与总生存率的关系图; B: PEA3蛋白表达情况与总生存率的关系图。

2.4 NSCLC患者不良预后危险因素的Cox回归分析

以NSCLC患者预后为因变量，患者临床病理参数及肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白表达为自变量进行Cox单因素回归分析，结果显示吸烟史、分化程度、TNM分期、淋巴结转移、胸膜转移、AP-1蛋白阳性表达、PEA3蛋白阳性表达是NSCLC患者不良预后的危险因素(P<0.05)。Cox多因素回归分析结果显示,TNM分期高、胸膜转移、AP-1蛋白阳性表达、PEA3蛋白阳性表达是NSCLC患者不良预后的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 NSCLC患者不良预后危险因素的Cox回归分析

3 讨 论

肺癌的发生、发展过程极其复杂，受多基因、多分子调控[8]。相关研究[9]显示，患者体液、细胞或组织中存在多种激素、酶、蛋白质、癌基因产物、转录因子等多种物质且与肿瘤生长显著相关，对肿瘤诊断、临床分期、预后评估等具有重要价值。

AP-1为一类重要的核转录因子，是由Jun蛋白和Fos蛋白组成的异源二聚体，一般可用c-Jun蛋白表达量来反映AP-1表达水平[7]。AP-1通过高度保守亮氨酸拉链与AP-1位点结合，激活靶基因转录及表达，与多种恶性肿瘤及免疫相关疾病的发生、发展密切相关[10-11]。LI S等[12]研究发现,AP-1可通过增加MMP-9基因表达促进结肠癌细胞SW620的侵袭和转移。王熠等[13]研究表明,AP-1在NSCLC患者肺癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织，且与NSCLC患者淋巴结转移、分化程度、组织学类型有关。PEA3是癌基因Ets家族中PEA3亚家族重要成员之一，在肿瘤发生、发展尤其是肿瘤侵袭、转移及肿瘤血管生成中发挥重要作用。朱春兰等[14]研究发现,PEA3在卵巢癌组织中呈显著高表达，与肿瘤大小、淋巴结转移、肿瘤分期及是否浸润密切相关。ETS变体4(ETV4)是最主要的PEA3因子,WANG Y等[15]研究表明,ETV4过表达与NSCLC患者淋巴结转移和不良预后密切相关。本研究结果发现,NSCLC患者肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05),提示肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达可能与NSCLC的发生有关。

进一步分析发现，肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白表达情况与NSCLC患者吸烟史、分化程度、TNM分期、胸膜转移、淋巴结转移有关，与肿瘤直径、组织学类型无关，与王熠等[13]结果不一致，这可能与本研究选取样本量少、选择范围局限有关。由此提示,AP-1、PEA3蛋白可能与NSCLC发生及病情进展有关，但有待进一步验证。抑制AP-1蛋白表达可增强NSCLC细胞系NCl-H1975化疗敏感性[16],PEA3亚家族蛋白与NSCLC晚期、淋巴结转移和不良预后有显著相关性[15]。本研究发现，肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达的NSCLC患者5年生存率远低于AP-1、PEA3蛋白阴性表达患者，且AP-1、PEA3蛋白阳性表达均是NSCLC患者不良预后的危险因素。由此提示，肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达与NSCLC患者不良预后有关，有潜力成为NSCLC患者预后评估的重要指标。

综上所述，NSCLC患者肺癌组织中AP-1、PEA3蛋白阳性表达是NSCLC患者预后不良的独立危险因素，故肺癌组织中AP-1、PEA3水平可能对NSCLC预后评估有一定意义。