HPLC法同时测定潞党参中四个苷类成分的含量

安 琪，孙 红，武林芝，刘亮亮，陈素娥

(山西卫生健康职业学院，山西 晋中 030619)

1 引言

党参为我国传统补益类中药，具有健脾益肺、养血生津之功效[1]。临床多用于机体免疫调节、心血管疾病、消化系统疾病等方面的治疗[2]。党参分布广泛，其中山西潞党历史悠久，品质优良。虽然山西已有规范化潞党参种植基地，但是依旧存在药农分散种植、缺乏种植技术规范化的指导和田间标准化管理，导致潞党参药材质量差异较大、种植品质得不到保障，因此对潞党参的质量评价显得尤为重要。

现行版《中国药典》(2020版)对党参的质量控制依旧延续2015版药典，仅对性状、鉴别、水分和浸出物检查项做了规定，通过这些检查项并不能完全体现出党参质量在量上面的差异，无法真正判断药材的质量优劣，目前药典尚无统一的定量评价指标。党参炔苷、党参苷(Ⅰ～Ⅳ)、lobetyolinin和紫丁香苷是党参中分离得到的重要苷类成分，均在免疫调节方面有很好的药理作用[3-4]，另外党参炔苷还具有抗癌和保护胃黏膜的作用[5-6]。为了完善潞党参药材全过程质量控制及质量溯源评价体系，明确潞党参中定量评价指标，确保潞党参临床使用的安全有效性，本文首次采用HPLC测定了平顺县和陵川县潞党参药材中四个主要苷类成分的含量。

2 仪器与材料

2.1 仪器

Agilent 1260 InfinityⅡ高效液相色谱仪；老肯LK/CSJ-30超声仪；梅特勒-托利多XPE105电子天平。

2.2 材料

色谱级甲醇、乙腈、磷酸均由天津市大茂化学试剂厂提供，水是纯净水，由杭州娃哈哈集团有限公司提供。

2.3 对照品

党参炔苷(纯度=99.21%，批号1506567)、紫丁香苷(纯度=99.12%，批号1506569)由伊普赛诺科技(天津)有限公司提供；党参苷Ⅰ(纯度≥98%，批号CHB180123)、Lobetylinin(纯度≥98%，批号CHB200721)由成都克洛玛生物科技有限公司提供。

2.4 药材

党参采购于潞党参的主产区山西省平顺县和陵川县，经山西卫生健康职业学院杨翠玲副教授鉴定为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula (Franch.)Nannf.干燥根，具体见表1。

表1 潞党参药材批号

3 方法与结果

3.1 色谱条件

采用Waters XSelect HSS T3(4.6×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈(A)-0.5%磷酸水(B)，流速设定为1.0 mL/min；检测波长为220 nm；进样体积10 μL；柱温设定为35℃。流动相梯度洗脱程序为：0～20 min, 5～10% A;20～70 min,10～30% A;70～71 min,30～95% A;71～80 min,95% A。

3.2 对照品溶液的制备

精密称取紫丁香苷、党参苷Ⅰ、Lobetyolinin和党参炔苷对照品，甲醇溶解，最后配制成浓度分别为250 μg/mL、2 mg/mL、2 mg/mL和5 mg/mL的对照品储备液。

3.3 供试品溶液的制备

药材粉碎过筛(3号筛)，取约2 g药材粉末，精密称定，置于150 mL具塞锥形瓶中，量取30 mL甲醇加入锥形瓶，振摇混匀，称定重量，提取30 min，称重并补足差额重量，取溶液至离心管中，14 000 rpm离心10 min，取上清液过0.45 μm滤膜得供试品溶液。

3.4 方法学考察

3.4.1 专属性 通过进样相同体积的空白溶剂、对照品溶液和样品溶液进行，典型色谱图如图1所示。结果显示样品溶液色谱图中紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷的保留时间与对照品溶液色谱图中对照品保留时间相对应，空白溶剂色谱图中相应保留时间处没有干扰峰，表明该方法专属性强。

图1 专属性色谱图A.对照品溶液色谱图;B.样品溶液色谱图;C.空白溶剂色谱图1.紫丁香苷;2.党参苷Ⅰ;3.Lobetyolinin;4.党参炔苷

3.4.2 线性关系 精密吸取“3.2”项下的对照品溶液，甲醇稀释，得到7个浓度的混合对照品溶液进样分析，以各色谱峰峰面积(Y)对浓度(X，μg/mL)进行线性回归，紫丁香苷、党参苷Ⅰ、Lobetyolinin和党参炔苷的回归方程、线性范围和相关系数(r)见表2。由表中数据可以看出，各成分线性关系良好。

表2 四个苷类成分的回归方程、线性范围和相关系数

3.4.3 精密度 取混合对照品溶液连续进样6次考察仪器精密度。计算紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷四个成分色谱峰峰面积RSD，分别为0.8%、1.0%、0.7%和1.9%，表明仪器精密度良好。

3.4.4 重复性 精密称取同一批党参药材(批号：2020102601)6份，制备供试品溶液，进样分析，外标法计算含量。紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷的含量RSD分别为2.9%、1.2%、0.7%和2.3%，表明方法重复性良好。

3.4.5 回收率试验 取同一批党参药材(批号：2020102601)6份，每份约1 g，精密称定，每份各加入一定量的紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷对照品溶液，依法制得供试品溶液，进样分析，通过峰面积计算含量，测的量减去初始量得到加入量，跟实际加入量相比较计算加样回收率。公式计算得四个苷类成分平均回收率分别为90.4%、96.8%、100.3%和101.6%，RSD分别为2.7%、2.5%、2.1%和2.3%，结果见表3。表明该方法准确度良好。

表3 紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷的回收率

3.4.6 稳定性 制备同一批潞党参药材(批号：2020102601)的供试品溶液，室温放置一定时间考察供试品溶液的稳定性。分别在0、2、4、8、12、24、48 h进样分析，计算紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷的峰面积RSD，分别为1.9%、2.1%、2.3%和1.3%。表明在48 h内供试品溶液室温放置稳定。

3.5 样品测定

取12批潞党参药材，平行制备供试品溶液各两份，进样分析，外标法计算紫丁香苷、党参苷Ι、Lobetyolinin和党参炔苷的平均含量，见表4。

4 讨论

试验中考察了甲醇及不同比例的甲醇水溶液作为提取溶剂，结果显示提取溶剂为甲醇时，四个苷类成分提取率符合要求，满足测定要求，而甲醇水溶液作为提取溶剂，样品室温放置过夜会有不同程度的沉淀析出，干扰检测，所以实验采用甲醇作为提取溶剂。

表4 潞党参药材中四个苷类成分含量测定结果(μg/g，n=2)

试验中对四个苷类成分进行紫外全波长扫描(190～400 nm)，紫丁香苷和党参苷Ⅰ在220 nm处有最大吸收，Lobetyolinin和党参炔苷在216 nm处有最大吸收，考虑到样品中紫丁香苷含量较低，选择220 nm为检测波长。四个苷类成分极性较大，在反相色谱柱上保留较弱，实验中考察了Agilent ZORBAX Eclipse plus、Agilent ZORBAX StableBond和Waters XSelect®HSS T3三根不同类型色谱柱，相比较另外两根色谱柱，HSS T3色谱柱对化合物有较好的保留，且在较短的分析时间内实现目标化合物完全分离。实验中考察了甲酸和磷酸不同添加剂对色谱分离的影响，结果发现乙腈-0.5%磷酸水溶液基线相对平稳，化合物分离较好。实验中对不同柱温和流速进行了优化，最终柱温选择35℃，流速选择1.0 mL/min。提取溶剂采用甲醇给色谱分析带来强的溶剂效应，试验中对进样量进行了优化，结果发现进样量为10 μL时溶剂效应消失，同时能够满足检测需求，本实验选择进样量为10 μL。

由测定结果可以看出，12批药材中均含有四个苷类成分，含量均呈现出党参炔苷>党参苷Ι>Lobetyolinin>紫丁香苷，表明不同采集地点潞党参中苷类成分较相似。12批药材中四个苷类成含量RSD分别为37.5%、21.4%、27.7%和26.0%，表明不同采集地潞党参药材中四个苷类成分含量差异明显，同为产区的药材中四个苷类成分的含量也存在差异，这可能与药材生长环境、栽培技术、储存环境等有关，该试验结果为潞党参苷类成分研究提供指导意义。同时该方法的建立为党参生产过程中产地环境选择，栽培技术优化，储存环境选择提供了新的分析方法和依据。

由表4分别计算两个产区四个苷类成分的平均含量，紫丁香苷和Lobetyolinin含量接近，平顺地区党参苷Ι含量稍低于陵川地区，而党参炔苷含量在平顺地区要远高于陵川地区，基于四个苷类成分的含量差异，进一步探讨以含量差异作为鉴定药材质量优劣的重要指标对于完善潞党参质量评价体系具有一定的参考意义。

5 结论

四个苷类成分已被证实是潞党参中特征性的药效关联成分，是潞党参药材中重要的药效物质基础，本方法采用HPLC建立了同时测定四个苷类成分的含量测定方法，方法准确可行、结果稳定可靠，为完善潞党参药材全过程质量控制及质量溯源评价体系，明确潞党参中定量评价指标，确保潞党参临床使用的安全有效性具有重要的意义，同时也有利于潞党参在大健康产品中的研发。