基于微流变技术研究不同嗜热链球菌对发酵乳凝胶化的影响

王月娇，郭 帅，韩之皓，黄 天，孙浩天，刘凯龙，王记成，孙天松，张和平

（内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室 农业农村部奶制品加工重点实验室 呼和浩特010018）

嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）被广泛应用于发酵乳制品中，常与德氏乳杆菌保加利亚亚种 （Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus）一起作为发酵剂菌株。嗜热链球菌产酸可促进乳制品发酵，缩短发酵周期，改善乳制品风味。发酵过程中产生胞外多糖使发酵乳形成黏稠的质地，提高其稳定性。嗜热链球菌还具有良好的益生特性，如抗氧化能力，调节肠道菌群等[1-2]。

微流变学是通过研究嵌入样品中微小粒子的布朗运动，分析流体在微米尺度的黏弹性和动力学特性，测量流体中颗粒因热能产生的位移，从而得到黏性性能。微流变原理是利用漫射波光谱法（Diffusing wave spectroscopy，DWS）[3-4]测定样品中颗粒大小及样品的微流变性质，也可用于研究食品凝胶过程，并测定凝胶网络结构的黏弹性[5]。例如：He 等[6]利用微流变技术研究淀粉对酸奶凝胶化过程的影响，结果表明淀粉可以增加酸奶的黏度，改善酸奶品质。

相比传统流变学，微流变学在静止状态下分析软物质微观结构，不会施加外力破坏样品凝胶结构，也不会影响样品原有状态[4]。本试验以不同嗜热链球菌复配保加利亚乳杆菌为发酵菌株，通过分析其发酵特性、贮藏特性和微流变学特性，筛选发酵性能较好的嗜热链球菌，为工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本试验所用的3 株嗜热链球菌和1 株保利加亚乳杆菌由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室提供，菌株来源详细信息见表1。试验所用纯牛奶为市售产品。MRS 液体培养基，广东环凯微生物科技有限公司；MRS 固体培养基，赛默飞世尔科技（北京）有限公司；ST 固体培养基，北京鼎持生物技术有限公司。

1.2 仪器设备

超净工作台，苏州苏洁净化设备有限公司；pH计，上海精密科学仪器有限公司；电热恒温水浴锅、生化培养箱，上海一恒科技有限公司；高压均质机，上海申鹿均质机有限公司；电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；光学法微流变分析仪，法国Formulaction 仪器公司。

2 试验方法

2.1 菌株活化

将真空冷冻干燥保存的嗜热链球菌分别接种于MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h，按2%的接种量接入MRS 液体培养基中，活化至3 代，使菌株活力达到最大，采用平板计数法确定活菌数，用0.85%的生理盐水重悬3 次得到菌悬液。

表1 菌株来源详细信息Table 1 Strain source details

2.1.1 发酵乳的制备 将鲜牛奶（94%）加热至60℃，加入蔗糖（6%），搅拌均匀至全部溶解，然后于65 ℃，20 MPa 条件下均质，在95 ℃，5 min 进行巴氏杀菌，冷却至（37±0.5）℃，接种发酵剂。嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌按接种活菌数比例为1 000∶1 添加，其中嗜热链球菌接种量为2×106CFU/mL，发酵至pH 值接近4.50，转置4 ℃冰箱后熟。发酵过程中每隔2 h 取样检测，贮藏期间每隔7 d 取样检测。

2.1.2 pH 值的测定 采用雷磁pH SJ-3F 型pH计直接测定，每个样品平行测定3 次，取平均值。

2.1.3 滴定酸度的测定[7]利用电子天平称取发酵乳样品10.0 g 于250 mL 三角瓶中，加入20 mL去CO2的蒸馏水，加入2 mL 0.5%的酚酞指示剂，充分摇匀后，用0.1 mol/L 的NaOH 标准溶液滴定至微红色，且5 s 内不消失为止。记录消耗NaOH标准溶液的体积（mL），每个样品平行测定3 次。

2.1.4 活菌数的测定 用移液枪吸取0.5 mL 发酵乳样品于4.5 mL 已灭菌的0.85%生理盐水中，摇匀后依次进行10 倍梯度稀释，采用MRS 固体培养基平板倾注法，37 ℃条件下静置培养48 h，计算菌落总数。

2.1.5 黏度的测定 将装有40 mL 发酵乳样品至于室温 （25 ℃） 下，采用Brookfield DV-1 VISCOMETER 型粘度仪进行3 次平行样测定，测定条件：选取4# 转子，转速100 r/min，扭矩10%～100%，测定时间30 s。

2.1.6 流变特性的测定 将20 mL 牛乳倒入特制的平底圆柱形带塞玻璃瓶中（内径27.5 mm），迅速转移至测定槽中，将流变仪主装置设置为37 ℃，每隔1 min 采集1 次数据，待发酵乳的pH 值接近4.50 后，立即取出玻璃瓶并放入4 ℃冷藏24 h，然后再将样品恢复到室温（25 ℃），搅拌后放入测定槽中继续采集数据[6]。

2.1.7 数据分析与处理 微流变数据使用Rheolaser Master 型光学法微流变分析仪中自带软件进行数据分析；各指标测定3 个平行值，利用SPSS 21.0 软件进行统计学分析，采用独立样本T检验（Independent-samples T-test）对3 组数据进行比较，显著性水平设定为0.05；所有图表采用Orginla lab 2017 软件绘制。

3 结果与分析

3.1 发酵乳在发酵过程及贮藏期间酸度的变化

菌株的产酸能力是筛选发酵剂的重要指标，产酸速率可以直接影响发酵乳的发酵时间、生产效率及风味[8]。3 株嗜热链球菌在37 ℃下恒温发酵牛乳样品，在发酵过程中及贮藏期间pH 值及滴定酸度变化如图1所示。在0～4 h，由于菌株处于延滞期，活力较低，生长速率慢，3 组样品的pH 值和滴定酸度无明显差异；发酵至4 h 时，菌株进入对数生长期，生长速率提高，GW21-4 组样品较其它2 组的pH 值变化明显，pH 值由6.51 下降至5.49，滴定酸度从15.12°T 上升至38.23°T；发酵至8 h 时，GW21-4 组样品到达发酵终点，pH 值为4.51，滴定酸度为85.3°T；XJ57-3 和ND03 组样品在9 h 到达发酵终点，pH 值分别为4.47，4.52，滴定酸度分别为80.2，72.12 °T。3 组样品相比，GW21-4 组样品的发酵时间最短，产酸速率最快。

贮藏期间酸度变化是衡量发酵乳品质的重要标准之一，样品酸度在70～110°T 之间口感较好，高于120°T 时则无法被消费者接受[9-10]。由于菌株产酸能力不同，样品在贮藏期间后酸化程度也有差异，菌株GW21-4 具有弱后酸化能力，pH 值仅降低0.26，滴定酸度增加20.12°T。低温条件下虽抑制乳酸菌活性，但仍有部分乳酸菌在β-半乳糖苷酶和其它酶的催化作用下继续产酸，使发酵乳酸度升高[10]。

图1 发酵过程及贮藏期间pH 值及滴定酸度变化Fig.1 Changes of pH value and titration acidity of different S.thermophilus during fermentation and storage period

3.2 发酵乳在发酵过程及贮藏期间活菌数的变化

乳酸菌活菌数可以直接影响发酵乳的品质、特性及口感[11]。3 株嗜热链球菌发酵乳活菌数变化情况如图2所示，3 组发酵乳样品在发酵过程中，由于营养物质充足，活菌数不断增加，到达发酵终点时，菌株XJ57-3 活菌数达到1.73×108CFU/mL，明显高于其它菌株。贮藏期间发酵乳活菌数呈现下降趋势，发酵乳酸度升高抑制乳酸菌生长，使乳酸菌总数减少；在贮藏结束后，3 组样品活菌数差异不显著（P＞0.05）。国家标准GB 19302-2010 规定[12]，发酵乳中乳酸菌活菌数应在106CFU/mL 以上，由图可知，所有试验菌株在发酵过程及贮藏期间活菌数均维持在106CFU/mL 以上，说明本试验所用发酵剂菌株在发酵乳中具有较好活力，可用于发酵乳的生产。

3.3 发酵乳在发酵过程及贮藏期间黏度的变化

黏度可以影响酸奶的组织状态和口感，有文献证明发酵乳黏度与胞外多糖含量有关[13]。添加不同嗜热链球菌制备发酵乳，发酵过程及贮藏期间黏度变化如图3所示。发酵过程中，由于酸度下降导致发酵乳中酪蛋白凝固以及菌株代谢分泌大量高分子化合物胞外多糖（EPS）导致样品黏度增加[14]；GW21-4 组样品于6 h 时凝乳，其余2 组在发酵8 h 时凝乳；发酵结束时，3 组样品黏度无存在显著差异（P＞0.05）。发酵乳样品在4 ℃条件下贮藏28 d，黏度呈先增加后降低的变化趋势；贮藏初期，在加工过程中破坏的凝乳微粒重新结合到凝乳微粒网状结构中，从而增大发酵乳的黏度；贮藏过程中由于少数乳酸菌在低温条件下继续产酸，破坏酸奶结构，导致贮藏后期发酵乳黏度下降[15]；3 组样品经4 ℃后熟，黏度达到最大值，其中GW21-4 组与XJ57-3 组和ND03 组黏度存在显著差异（P＜0.05）。贮藏28 d 时，GW21-4 组样品黏度最大。

3.4 发酵乳发酵过程微流变检测结果

发酵乳的凝胶结构主要是在发酵过程中，由于乳酸菌不断产酸，使pH 值降低至酪蛋白等电点而形成的，而凝胶结构也会受酸度和温度的影响，酸度升高不仅作用于表面，还影响胶体内部结构。牛乳的pH 值约为6.7 左右，酪蛋白以酪蛋白-磷酸钙复合体形式存在[16]；当发酵开始时，pH 值逐渐下降，胶体磷酸钙溶解，酪蛋白胶束开始解离[17]；pH 值下降至5.2 左右时，解离后的单体酪蛋白相互结合形成松散的、无定形结构的聚集体，此时发酵乳形成一定的凝胶结构，称为凝胶点[14]；pH值到达酪蛋白等电点时，发酵乳的凝胶网络结构形成。乳的酸致凝胶形成是一个多级过程，包括低黏度的初始停滞阶段、黏度的快速变化阶段和高黏度阶段[18]。

图2 发酵过程及贮藏期间活菌数变化Fig.2 Changes of viable bacterial counts of different S.thermophilus during fermented and storage period

微流变仪通过检测激光信号变化计算出颗粒运动速度及均方根位移，基于均方根位移大小变化可得出样品的弹性因子指数 （Elasticity index，EI）、宏观黏度指数（Macroscopic viscosity index，MVI）及固液平衡值（Solid-liquid balance value，SLB），可以反映发酵乳的黏弹性等特征[19]。

弹性因子可以快速、简单描述样品的弹性特征，还可以检测弹性随时间变化过程，EI 值与凝胶弹性变化呈正比，EI 值越大，凝胶弹性越强，表明样品中颗粒在悬浮液中可以很好“固定”，样品的稳定性好。发酵乳发酵过程中及后熟期间弹性因子变化过程如图4所示。3 组样品0～5 h 差异不明显，表明此时酪蛋白没有形成凝胶结构；随着发酵时间的延长，3 组样品EI 值明显升高；GW21-4 组上升速度高于XJ57-3 组和ND03 组；GW21-4 组在发酵6 h 左右EI 曲线出现拐点，表明发酵乳形成凝胶结构弹性达到最大值，即达到凝胶点，而其余2 组样品约在8 h 左右达到凝胶点；达到凝胶点后，3 组样品的EI 值增加达到最大值，GW21-4组EI 值高于其余2 组样品。后熟期间，3 组样品的EI 值有一定升高，表明形成了更结实的发酵乳。

图3 发酵过程及贮藏期间黏度变化Fig.3 Changes of viscosity of different S.thermophilus during fermented and storage period

图4 发酵过程及后熟期间弹性因子（EI）变化Fig.4 Changes of elastic index （EI） during fermentation and post-ripening

3 组样品的黏度因子变化由图5可知，在发酵初期，由于酪蛋白没有形成凝胶结构，3 组样品的MVI 值处于波动状态；pH 值持续降低使酪蛋白胶束所带净负电荷含量减少，胶束间静电斥力下降，影响了胶束的稳定性，酪蛋白胶束开始解离，进而使溶解度下降[20-21]；GW21-4 组样品MVI值上升速度高于XJ57-3 组和ND03 组；样品到达凝胶点，解离后的酪蛋白重新聚集开始形成一定的凝胶结构，3 组样品的MVI 值达到最大；由于嗜热链球菌不断产酸，使pH 值逐渐接近酪蛋白等电点，酪蛋白胶束排斥力减小，疏水作用增强，酪蛋白粒子快速聚集和重新排列形成蛋白质凝胶结构，到达发酵终点时，GW21-4 组的MVI 值最大[21]。后熟结束后，GW21-4 组样品的MVI 值高于其它2 组，与上文研究黏度测定结果相同。

固液平衡值是指发酵乳在发酵过程中，每个时间所具有固态和液体特征的比值。样品具有固体性质时，SLB 值为0；样品具有弹性或固体特性时，SLB 值为0～0.5；样品具有黏性或液体特性时，SLB 值为0.5～1；样品具有液体状态时，SLB 值为1[23]。如图6所示，所有样品的SLB 值处于波动状态，NDO3 组样品的SLB 值最大状态偏向于液体特性；由于酸度持续降低，SLB 值出现拐点，表明此时单体酪蛋白重新聚集形成胶粒，使溶解度降低，黏度增大；到达样品凝胶点，凝胶结构使样品状态倾向于固体特性，表明体系中胶体微粒的迁移受到酪蛋白聚集的影响。有研究表明当pH 值不断接近发酵终点时，SLB 值逐渐上升后趋于平缓，酪蛋白胶束最终凝结成三维空间网络状结构[22]。发酵结束后，GW21-4 组和ND03 组样品的SLB值低于XJ57-3 组，说明GW21-4 组和ND03 组样品状态更接近于固体特性；经过4 ℃后熟，GW21-4 和ND03 组的SLB 值较低，表明其状态更多表现为固体特性。

3 组样品在发酵过程中和后熟期间，3 株嗜热链球菌对发酵乳凝胶结构的影响存在差异性。GW21-4 组对比其它组，发酵乳具有较高黏度，发酵乳的结构变得紧密，SLB 值较低验证了发酵乳具有固体结构特性。有研究表明不同发酵剂菌株发酵乳的凝胶硬度存在差异，产EPS 菌株可以提高搅拌型发酵乳的表观黏度，然而未发现EPS 产量与黏度之间的相关性[18]。

图5 发酵过程及后熟期间黏度因子（MVI）变化Fig.5 Changes of macro viscosity index （MVI）during fermentation and post-ripening

图6 发酵过程及后熟期间固液平衡值（SLB）变化Fig.6 Changes of solid-liquid equilibrium （SLB）during fermentation and post-ripening

4 结论

本研究利用3 株嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌复配发酵，研究发酵乳的发酵特性、贮藏特性和流变学特性，以筛选出优良的发酵剂菌株。结果表明，嗜热链球菌（S.thermophilus）GW21-4 具有良好的发酵特性和贮藏稳定性，在发酵过程中可以维持较高的黏弹性，可以使酪蛋白凝胶网状结构更加坚固。综上，嗜热链球菌GW21-4 在乳制品开发利用中具有良好的应用潜力。