人类肠道菌群中抗生素耐药基因的研究进展

李海北，杨沂嫡，李君文，金 敏

（军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津市环境与食品安全风险监控技术重点实验室，天津 300050）

抗生素耐药性的不断出现已经成为全球公共卫生的一大威胁。多年来，在不同的环境如土壤、污水、饮用水甚至空气[1-3]中，几乎检测到所有种类的抗生素耐药基因（antibiotic resistance genes,ARG）。因此，ARG被视为一种新型环境污染物，需要全球予以战略应对。同时，人类肠道菌群作为ARG的重要储存库[4-5]，为ARG的水平基因转移（horizontal gene transfer,HGT）提供了便利。ARG不仅可以在肠道菌群内部进行交换，而且可以转移到其他短暂通过肠道的细菌[6-8]。HGT在人类肠道菌群间频繁发生，条件性致病菌可通过HGT获得ARG，对人类健康造成重大危害。

人类肠道微生物组含有大量ARG，现有的测序技术和实验手段可以揭示肠道中抗性基因在物种间传播的程度。ARG的有效鉴定有助于开发有针对性地减少或控制人类肠道中抗生素耐药性的方法。本文首先概述人类肠道菌群中ARG的种类、产生和传播方式及原因，最后总结ARG的检测方法，以期促进对人类肠道ARG的了解，并提供新思路。

1 人类肠道菌群中ARG的种类

ARG种类繁多，其中抗生素耐药基因数据库（Antibiotic Resistance Genes Database）收集了377种类型的13 293个ARG，共对257种抗生素耐药[9]。人类肠道菌群作为ARG的储存库，含有众多类型的ARG。Ruppe等[10]开发了一种基于三维结构的注释方法，在人类肠道中预测鉴定出6095个新型ARG。Lu等[11]从124名健康中国人的肠道菌群中检测出80种ARG，包括对氨基糖苷类、青霉素类、β-内酰胺类、酰胺醇类、甲氧苄啶类、大环内酯类-林可酰胺类-链阳性菌素B类、磺胺类和四环素类等抗性基因。Feng等[12]检测了来自11个国家的180名健康人粪便样品，共检测到507种ARG亚型，隶属于20个ARG类型，其中四环素、多药类、大环内酯类-林可酰胺类-链阳性菌素B类、杆菌肽、万古霉素、β-内酰胺和氨基糖苷类ARG居前7位。人类肠道菌群中最常见的耐药基因类型是四环素类耐药基因，普遍存在tetQ，tetO，tetw，tet32和tet40等5种基因型[13]。

2 人类肠道菌群中ARG的产生和传播方式

细菌的抗生素耐药性可通过基因突变获得，也可以通过HGT从其他菌株获得。某些抗生素作用靶点的基因突变可能会使细菌产生抗生素耐药性，如23S rRNA基因突变[14]。此外，Olliver等[15]发现，外排泵相关基因acrR突变可导致鼠伤寒沙门菌对氟喹诺酮类耐药。HGT可在任何环境中发生，如土壤[16]、废水处理厂[17-18]以及人和动物的肠道菌群中[19-21]。通过HGT实现基因的共享对ARG的广泛传播起着重要作用[22]。ARG可通过多种方式进行HGT，其中最重要的是转化、转导和接合转移。

2.1 转化

转化是指细菌从周围直接吸收和整合外源遗传元素，如质粒等无细胞DNA（cell-free DNA）。已报道超过80种细菌具有天然转化能力[23]。重要病原体包括淋病奈瑟菌、霍乱弧菌和肺炎链球菌具有自然转化能力，并可以通过转化过程获得抗生素耐药性[24]。肠道中的DNA酶能够降解大多数DNA，但Wilcks等[25]从质粒喂养的大鼠肠道内容物中分离出了完整的质粒DNA。研究发现，在自然条件下质粒能够转化进入大肠杆菌[26-27]，表明大肠杆菌可以在肠道中吸收DNA。Ding等[28]发现了RK2质粒携带的氨苄青霉素抗性基因在小鼠肠道菌群中的转化和扩散。上述研究表明，转化有助于肠道中ARG的传播。

2.2 转导

转导是通过噬菌体在细菌间传递基因的过程。人类肠道中不仅包含大量的噬菌体[29]，而且在肠道噬菌体中检测到ARG[30]，这为肠道内ARG的转导提供了便利条件。小鼠模型实验表明，转导是肠道大肠杆菌基因多样性的驱动力[31]，可以促进肠道细菌产生耐药性[32]。然而，噬菌体对ARG水平转移的作用却知之甚少。

2.3 接合转移

在接合转移过程中，可移动的遗传元素，如质粒和整合性结合元件（integrative and conjugative elements），可以从一种细菌转移到另一种细菌[33]。接合质粒可以携带多个抗性基因，并且含有毒素-抗毒素系统，以确保质粒保留在微生物宿主内[34]；此外，接合质粒还能携带有助于微生物适切性（microbial fitness）的基因，如对消毒剂或重金属耐受性的基因[34]。接合转移是一个复杂的、多阶段的、依赖于接触的过程，其中DNA在彼此靠近的细菌之间传递[35]。Fu等[36]证实，耐药质粒在斑马鱼肠道内可接合转移。在人类肠道中，抗生素耐药质粒和整合性结合元件在共生菌和条件致病菌中亦可广泛传播[37-39]。

3 导致人类肠道菌群中ARG产生和传播的因素

许多因素可导致人类肠道ARG的产生和传播，除通过食物和水等介质经口引入外源ARG外，抗生素和非抗生素药物的暴露诱导以及母婴传播，也是肠道ARG产生和传播的重要因素。

3.1 抗生素

临床抗生素的不合理使用是肠道ARG产生的主要原因，临床长期使用抗生素使肠道中相应的ARG更为丰富。Jakobsson等[40]发现，受试者在接受抗生素治疗后，肠道中大环内酯类抗性基因ermB水平提高了3～5个数量级。Buelow等[41]发现，使用选择性消化道净化治疗（selective diges⁃tive decontamination）的患者体内ARG（氨基糖苷类、大环内酯类、喹诺酮类和四环素类）水平显著提高。另外，畜牧业和水产养殖中滥用抗生素，不仅造成动物源性食品中抗生素的积累[42]，而且这些抗生素可通过食物链进入肠道，加剧肠道ARG的产生。人类肠道中，丰度较高的耐药基因往往对应着经临床长期使用或经国家批准用于家畜的抗生素。

除诱导ARG的产生，抗生素还能促进ARG的传播。Jutkina等[43]发现，低浓度四环素能够诱导ARG的HGT。此外，Wu等[44]发现，左氧氟沙星能够诱导转化，促进耐药大肠杆菌的传播。

3.2 非抗生素类药物

非抗生素类药物在诱导抗生素耐药性方面也具有重要作用。Maier等[45]观察了1000多种药物对人类肠道菌群的影响，发现24%的药物在体外至少抑制1种菌株的生长；此外，细菌对非抗生素类药物的耐药机制竟然与对抗生素的耐药机制具有重叠部分，这意味着非抗生素类药物的使用可能诱导人肠道ARG的产生，加剧抗生素耐药性。Lyte等[46]发现，抗抑郁药氟西汀能够作用于肠道，减少肠道菌群的丰度。Jin等[47]发现，氟西汀能够体外诱导大肠杆菌基因突变，导致多重耐药性。因此，氟西汀很可能作用于人类肠道，诱导ARG的产生。

与抗生素类似，非抗生素类药物也能促进ARG的传播。Wang等[48]发现，抗癫痫药物卡马西平促进耐药基因在细菌属内和细菌属间的水平转移。此外，Wang等[49]报道了5种非抗生素类的人类靶向药物，包括抗炎药物（布洛芬、萘普生和双氯芬酸）、降脂药物（吉非罗齐）和β-受体阻滞剂（普萘洛尔），能够促进ARG的转化。因此，非抗生素类药物暴露可能是肠道ARG产生和传播的另一主要诱因。

3.3 母婴传播

研究表明，新生儿即使未接触过抗生素，但其肠道内也有较高水平的ARG[50-51]。在无抗生素选择压力下，新生儿肠道菌群内大量ARG的来源引起了广泛关注。Gosalbes等[52]在胎儿的胎便中发现了ARG，提示母体肠道内的ARG可能转移至胎儿肠道内。新生儿体内ARG的来源除母体肠道，还有母乳。Jost等[53]发现，细菌可通过母乳喂养从母体转移到新生儿，重塑新生儿的肠道菌群。此外，Parnanen等[54]发现，部分ARG可通过母乳喂养传递到新生儿肠道。母体来源的细菌和ARG可能通过母婴传播转移到胎儿和新生儿肠道。

3.4 食物

食物中不仅可能含有抗生素耐药性细菌（anti⁃biotic-resistant bacteria,ARB），还可能出现“超级耐药菌”。Aarestrup等[55]在家禽和猪中检测到了阿维拉霉素、阿伏霉素、杆菌肽、泰乐菌素和维吉尼亚霉素等ARB。Janecko等[56]在加拿大海产品中检测出携带有超广谱β-内酰胺酶基因（包括blaNDM-1）的耐药菌。Liu等[57]在中国南方猪的肠杆菌科细菌中检测出超级耐药基因mcr-1。Hamza等[58]在埃及养殖家禽中检测到含有blaNDM-1和blaKPC等超级耐药基因的肺炎克雷伯菌。含有ARB的食物如未经适当烹调，一旦进入人体，将有可能定植于肠道，促进肠道ARG的产生和传播，对人类健康带来巨大风险[59-60]。Bertrand等[61]发现，人体通过摄入食物，可以将家禽体内的氟喹诺酮类和环丙沙星等抗性基因转移至自身肠道内。

3.5 饮用水

饮用水水源部分来自于江河湖泊等地表水，而ARG可通过人类排泄物和动物粪便等进入地表水，从而造成污染。因此，一旦生活饮用水处理工艺对ARG去除不彻底，将会导致ARG通过市政供水系统传播[62-64]，进入人体肠道，从而威胁人类健康。刘珊珊等[65]在天津市某地区自来水样品中检测出β-内酰胺类、磺胺类、四环素类和氨基糖苷类等ARG。Hao等[66]在天津市某地区自来水样品检测出15种ARG，分别是 tetA，tetB，tetM，tetQ，tetX，sul1，sul2，sul3，ermB，blaTEM和qnrA。Khan等[67]在配水系统中发现mcr-1和blaNDM-1等耐药基因的扩散，并且mcr-1可从饮用水传播到健康小鼠的肠道。

4 人类肠道菌群中ARG的检测方法

迄今为止，人们已经用不同的方法对人肠道菌群中的ARG进行了鉴定，包括抗生素耐药菌株的分离培养、定量PCR、微阵列分析、宏基因组测序、功能性宏基因组和单细胞全基因组等技术（图1）。应用这些方法已经鉴定到了大量的ARG，并进一步增加了人们的共识，即人类肠道菌群是ARG的储存库。

图1 肠道菌群中耐药基因研究的主要技术.

4.1 抗生素耐药菌株的分离培养

传统的分离培养技术是鉴定环境中抗生素耐药性的经典方法。使用带有选择性抗生素的培养基可以对肠道中特定的细菌群进行计数和分离。分离菌株的抗生素耐药性可通过微量肉汤稀释法和琼脂稀释法进行测量。Mandar等[68]从健康儿童的粪便中分离出60株乳杆菌，发现所有菌株均对甲硝唑耐药，而其中73%菌株对万古霉素耐药。Delgado等[69]从8名健康人的粪便中分离出122株双歧杆菌和乳杆菌，其中大约1/2乳杆菌对头孢西丁有耐药性，而约30%双歧杆菌对四环素具有耐药性。一般来说，依赖于培养的方法是费时费力的，但有助于分析细菌的耐药表型和基因型，并进一步评估其对人类健康的潜在风险。

4.2 定量PCR和微阵列芯片

除实验室培养外，还存在几种无需培养的方法，可以从粪便样本中分离DNA来检测肠道菌群中的ARG。从粪便中提取细菌DNA，使用定量PCR或微阵列芯片可对特定ARG进行定量。Jernberg等[70]通过定量PCR发现，服用克林霉素后，受试者粪便中特异性耐药基因水平显著升高。Buelow等[71]通过定量PCR发现，使用选择消化道净化治疗疗法的ICU患者肠道中富含氨基糖苷类耐药基因。Card等[72]通过微阵列芯片技术检测健康成年人的唾液和粪便微生物组，共检测到14个6类抗生素（氨基糖苷类、β-内酰胺类、大环内酯类、磺胺类、四环素类和甲氧苄啶类）的ARG。Lu等[11]通过DNA微阵列芯片发现，人类肠道菌群中的ARG从儿童期到成年期不断积累，并随着年龄的增长而变得更加复杂。然而这些方法的检测范围有限，只能针对特定的ARG设计引物或探针。此外，定量PCR和微阵列芯片方法不能提供有关ARG的遗传背景或细菌宿主的信息。

4.3 宏基因组测序

宏基因组学可研究样本中生物群落的所有基因组序列。该方法可用于确定微生物群的系统发育组成，并可用于定量检测微生物群中的ARG[73]。宏基因组分析是探索人肠道ARG的有力工具，能够发现新ARG和耐药性新机制。Hu等[74]对人肠道宏基因组进行分析，发现了1093个ARG；而且还发现中国人的ARG数量和丰度最高，其次是丹麦人和西班牙人。

4.4 功能宏基因组测序

功能宏基因组已被广泛用于人类肠道抗性组的研究，为宏基因组测序研究提供了重要的补充。利用功能宏基因组学的方法，将粪便DNA随机克隆到大肠杆菌载体中，然后将随机克隆的DNA文库涂布在含有抗生素的培养板上，从文库中分离出耐药性克隆；最后对阳性克隆的载体进行测序，以确定对特定抗生素产生耐药性的基因[75-76]。Sommer等[77]采用功能宏基因组技术对2名健康人的粪便和唾液中的抗性组进行研究，共分离出290个抗生素耐药克隆，筛选出13种抗生素的表型抗性文库。一项类似的研究发现，22名健康婴儿和儿童的抗性组已高度多样化，对检测的18种抗生素中的14种耐药[78]。

4.5 单细胞基因组技术

在一个生态系统中，群体中的微生物基因组具有高度的异质性，并且拷贝数通常低于常规方法所能检测的下限[79]。单个细胞中基因的动态变化可以调控多个生物学过程，因此将细胞异质性考虑在内是非常重要的。然而，在单细胞水平上，确切的遗传机制及其在抗生素耐药性中的作用仍不清楚[80-81]。单细胞测序旨在通过剖析单个细胞的贡献来解析基因组学。

单细胞基因组可用于直接鉴定和组装不可培养的细菌或病毒的基因组，从感兴趣的微生物中识别ARG。理论上，在单个细胞中出现抗生素耐药性可以使其存活、增殖，并最终在抗生素的选择性压力下战胜其他菌株。在肠道中，HGT的频率可能非常低，使用传统的培养方法跟踪这种罕见的事件非常困难，单细胞基因组测序技术很好地解决了这一难题。单细胞基因组学也有助于揭示异源抗性的基因组机制，并有助于深入了解在选择压力下细菌代谢的变化[80,82]。

5 结语

抗生素耐药性是一个日趋严重的全球性问题，预计在未来几年将成为人类死亡的主要原因。ARG作为新型环境污染物所造成的环境问题和对人类健康的影响已不容忽视。人类的肠道就像陆地和水生环境一样，扮演着储存ARG的角色。人类肠道中ARG种类繁多，并且肠道内大量细菌和稠密的黏液层也为ARG的传播提供了便利的环境。

ARG由于HGT而变得活跃。ARG从肠道共生体到条件病原菌的HGT可能导致多药耐药菌株的出现。转化可能有助于肠道中ARG的传播，然而在转化过程中，DNA在肠道里扩散的程度目前尚不清楚。噬菌体能传递供体细菌任何基因的转导，然而质粒的接合转移仍然被广泛认为是细菌间传递ARG的最重要途径。加强对肠道中HGT事件的了解将为减少ARG的转移开辟新的途径。

在临床和动物食品工业中，抗生素滥用是ARG在人体肠道中累积的主要原因。近年来，越来越多的研究揭示了非抗生素类药物在诱导抗生素耐药性中的重要作用[47-48]，这应引起我们足够的重视。此外，已有大量研究在食物和饮用水中检测出ARB和ARG[56,83]，这些ARB和ARG可能通过食物链进入人体肠道，在肠道细菌之间传播，对人体健康造成重大威胁。因此，迫切需要采取全球性行动，制定干预措施，减少人类肠道中ARG的产生和传播。

近年来，随着二代测序技术的迅猛发展，宏基因组测序成为研究肠道菌群中ARG的主流技术。随着研究的不断深入，单纯的宏基因组测序已无法满足科研人员的需求。功能宏基因组和单细胞测序技术的发展为探究肠道中ARG的存在、传播和功能提供了切实有效的手段。然而现有的方法仍存在局限性，需要继续研究更为可靠和准确的ARG的检测、预测和注释方法。人类肠道ARG组有望成为未来几年的研究热点。