一种油菜及其近缘植物干种子基因组DNA提取方法

2021-05-15范惠玲白生文侯丽娟

河西学院学报 2021年2期

范惠玲白生文侯丽娟

（1.河西学院农业与生态工程学院；2.河西学院生命科学与工程学院，甘肃张掖 734000）

高丰度、高纯度DNA 分离提取往往是对农业上许多重要性状进行遗传分析的限制因素.干燥种子由于DNA 与组蛋白等紧密结合，导致提取高质量、高丰度DNA 具有一定的难度.从含有大量蛋白质、多糖类物质的干种子中，分离出高质量DNA 的难度则更大［1］.DNA样中混杂的酚类、色素、多糖和蛋白质等还会干扰一些生物酶的活性，如DNA 聚合酶、连接酶和限制性核酸内切酶等，进而干扰后续实验的进行［2］.解决这类问题的关键则是在DNA提取过程中有效去除蛋白质、多糖、色素等杂质.基于这一问题的出现，目前关于从种子中提取DNA的大量实验方法见诸报端，如Chunwongse等［3］发明了从水稻和小麦中用半粒种子提取DNA的方法；Mcdonald 等［4］和Kang等［5］发明了从棉花、花生、大豆等作物种子中提取DNA的方法；国内也有很多学者相继发明了一些从种子中提取DNA的方法［6-13］.尽管这些方法在不同的植物种子上都取得了较好的提取效果，但对于油菜及其近缘植物干种子DNA的提取存在或多或少的不足.至今，关于油菜及其近缘植物干种子DNA提取的文献报道较少.谢景梅等［14］以黑籽和黄籽甘蓝型油菜为材料，用改良的CTAB 法提取了基因组DNA，DNA 样品液A260/A280的值介于1.47～1.66 之间，低于1.8，表明DNA样品的纯度并不理想.丹巴等［15］用SDS法和CTAB法提取了西藏黄籽油菜干种子的DNA，所提DNA样品液适用于SSR分析，但只用了甘蓝型油菜，未涉及其它两种类型油菜乃至油菜近缘植物.沙爱华等［16］分别以油菜、水稻、玉米和棉花的干种子为试材，建立了一种DNA提取的简便方法，结果分离到了一定量的DNA且可用于RAPD和SSR分析，但DNA样品的纯度较低.

鉴于此，针对油菜、芸芥和白芥籽粒中贮藏较多的脂肪、蛋白质、糖类和次生代谢物等的特点，我们结合已报道的从植物干燥材料中分离基因组DNA的不同方法，试图探索一种从干种子中分离DNA的有效方法，同时用油菜总DNA的纯化提取法作为对照［17］，以期建立一种能够适用于油菜及其近缘植物干种子的高质量DNA提取方法，为快速高效地对科研和商场上杂交种纯度的鉴定、种质资源的遗传多样性分析等工作奠定分子基础.

1 材料与方法

1.1 试验材料

油菜的三大栽培类型：陇油2 号系甘蓝型油菜（Brassica napus L.）、天油5 号系白菜型油菜（Brassica campestris L.）、靖油1号系芥菜型油菜（Brassica juncea L.），油菜的两种近缘植物：武威毛角系白芥（Sina⁃pis alba L.）、和田芸芥系芸芥（Eruca sativa M.），均由甘肃省张掖市河西学院农业与生物技术学院农学教研室提供.

1.2 主要试剂与仪器

50mmol/LEDTA、氯仿-异戊醇、3mol/LNaCl 溶液、TE 缓冲液（pH=8）、3%CTAB、1%Gold View Ⅰ型核酸染色剂、ddH2O、10×buffer（含20mmol/L Mg2+）、Taq DNA聚合酶、1×TAE电泳缓冲液以及随机引物.其中随机引物由上海生物工程有限公司合成，其名称和序列详见表1.PCR扩增所用试剂由北京鼎国生物技术有限公司提供，其它试剂均为分析纯.

表1 PCR扩增所用的引物名称和序列Table 1 Name and sequence of primers used for amplification

My cyclerTM 热循环仪、Nanaphotometer 微量核酸蛋白分析仪、离心机、电泳仪.

1.3 干种子基因组DNA提取

将干种子0.5g 置于研钵中，用研棒压破，加几颗石英砂后研磨成颗粒，加入700μL 提取液（3%CTAB，1%二硫苏糖醇，2%PEG，50mmol/L EDTA），再次研磨成匀浆；匀浆转入离心管中，并置于65℃水浴中保温15分钟，其间每间隔5分钟轻轻摇动离心管1次，以充分裂解；离心管置冰浴冷却后，加入500μL氯仿-异戊醇，混匀后，12000转/分钟离心5分钟，得到上清液（A）；在300μL上清液A中加入100μL 3mol/L的NaCl溶液，摇匀后加入600μL预冷无水乙醇，冰浴静置10分钟；低温下12000转/分钟离心10分钟，得到沉淀物（A）；在沉淀物A中加入300μL 1mol/L 的NaCl 溶液，待沉淀物溶解后再加入300μL氯仿-异戊醇，轻轻混匀，低温下12000转/分钟离心5分钟，得到上清液（B）；在300μL上清液B 中依次加入30μL 1 mol/L 的NaCl 溶液和600μL 预冷无水乙醇，冰浴静置10 分钟，在4℃的条件下12000 转/分钟的离心10 分钟，得到沉淀物（B）；向沉淀物B 中加入75%的乙醇300μL，洗涤沉淀2 次，自然风干该沉淀物；加入100μL pH=8的TE缓冲液，充分溶解后得基因组DNA样品液，-20℃保存备用.

对照：参照周延清（2005）的方法提取油菜及其近缘植物干种子基因组DNA.

1.4 PCR扩增体系及程序

针对前面本研究中的DNA提取方法获得的甘蓝型油菜、白菜型油菜、芥菜型油菜、白芥和芸芥五份DNA，利用10条随机引物分别对他们进行扩增.反应总体积为25μL：18.5μL ddH2O、2.5μL 10×buffer（含20mmol/L Mg2+）、1 U Taq DNA聚合酶、1μL引物、1μL模板DNA.PCR扩增反应在My cyclerTM 热循环仪上进行.扩增程序为：94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，37℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，扩增35个循环，最后72℃延伸10分钟.

1.5 基因组DNA纯度和浓度检测

采用Nanaphotometer 核酸蛋白分析仪测定上述五份基因组DNA 样品的OD260/OD280、OD260/OD230、OD320值和浓度.

1.6 电泳

用本试验中的提取方法获得的基因组DNA，每份样品液吸取1μL，分别加入6μL Loading buffer，在1.5%的琼脂糖凝胶（含1%Gold View Ⅰ型核酸染色剂）中电泳分离.基因组DNA的PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶中分离.1×TAE为电泳缓冲液，按5V/cm电泳40分钟.在凝胶成像系统上观察DNA的完整性、扩增产物的多态性、照像并保存.

2 结果与分析

2.1 油菜及其近缘植物干种子基因组DNA样完整性检测结果

从图1可以看出，第1、2、3、7、9各泳道中的DNA带型清晰，无拖尾现象，表明DNA未发生降解；第4、5、6各泳道中，DNA主带模糊不清，出现明显的地毯带，表明DNA样已严重降解且内含杂质.第8和第10条泳道中，DNA主带虽较清楚，但带型成锯齿状，且泳道中出现一定的拖尾现象，表明DNA有轻微的降解现象，并含有一定量的杂质.

图1 三种类型油菜及其近缘植物干种子基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图Fig.1 Detection of DNA integrity by electrophoresis on agrose gel

2.2 油菜及其近缘植物干种子基因组DNA纯度和浓度检测结果

OD320为检测DNA样品溶液的浊度和其他干扰因子，该值应该接近0［17］.由表2可知，当采用本试验的方法提取时，OD320的测定值介于0.000～0.002 之间，其平均值为0.0008，接近于0，表明所抽提DNA样品中悬浮物的量较少；当采用对照方法提取时，OD320的值介于0.008～0.01之间，均值为0.0262，明显大于0.000，表明所抽提DNA样中含有一定量的悬浮物.

若所测DNA样的OD260/OD280≈1.8，说明所提取的DNA样纯度较高，无蛋白质污染［17］.当用对照方法提取时，OD260/OD280的值为1.250～1.677，均值为1.4238，明显小于1.8，表明所提取DNA 样的纯度较低，有蛋白质等杂质污染；而当用本试验的方法提取时，三大类型油菜及其近缘植物的OD260/OD280的值在1.792～1.905之间，均值为1.861，表明所提取DNA样的纯度较高.

较纯净的核酸其OD260/OD230的比值大于2.0.若比值小于2.0，表明样品被糖类等污染［17］.当用对照方法提取时，五种材料DNA 样品液的OD260/OD230的值介于0.934～1.721 之间，均值为1.375，明显小于2.0，表明所提DNA样已被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染；当用本试验的方法提取时，所有材料的DNA样品液其OD260/OD230的值均大于2.0，均值为2.176，表明所提取DNA样液没有被碳水化合物、盐类所污染.

就基因组DNA样的浓度而言，当用本试验的方法提取时，从甘蓝型油菜和芥菜型油菜干种子中所得的DNA样的浓度较高，分别为1130μg/mL和975μg/mL，而白菜型油菜的较低.五种材料的DNA样的平均浓度为814μg/mL；当用文献法提取时，所有材料DNA 样的平均浓度为767μg/mL，DNA 样的浓度在523～1046μg/mL 之间变化.表2 结果还表明，从芸芥和白芥这两种油菜近缘植物干种子中分离出的DNA样的浓度明显低于三大类型油菜的.综上可见，采用本试验方法，可以从三大类型油菜及其近缘植物干种子中分离提取出一定浓度且纯度较高的基因组DNA样.

表2 不同提取方法所得油菜及其近缘植物干种子基因组DNA纯度和浓度检测结果Table 2 Concentration and OD value of genomic DNA from rapeseed and its closely related plant seeds

2.3 油菜及其近缘植物干种子基因组DNA的PCR扩增结果

DNA质量的好坏决定着下游实验的顺利与否.用本试验的提取方法获得的基因组DNA作模板，通过PCR扩增反应，琼脂糖凝胶电泳能够顺利完成（图2、图3），扩增产物亦清晰可辨，通过多条引物的扩增，能够实现多态性片段的分离.本研究的10条随机引物中，有6条在5份基因组DNA样品中均能扩增出谱带，图2和图3只是部分扩增结果.这些结果表明，使用该方法提取的DNA能够胜任RAPD扩增实验.

图2 三大类型油菜干种子基因组DNA的PCR扩增产物电泳图谱左：甘蓝型油菜、引物S121；中：白菜型油菜、引物66；右：芥菜型油菜、引物170Fig.2 PCR amplification profiles of genomic DNA from dry oilseed seedsLeft：B.napus，S121；Medium：B.campestris，S66；Right：B.juncea，S170

图3 油菜近缘植物干种子基因组DNA的PCR扩增产物电泳图谱左：白芥；右：芸芥引物：S345Fig.3 PCR amplification profiles of genomic DNA from dry S.alba and E.sativa seedsLeft：S.alba，S152；Right：E.sativa，Primer：S345

3 讨论

3.1 确定了一种从三大类型油菜及其两种近缘植物干种子中分离提取高纯度DNA的方法

以种子为材料进行DNA提取在小麦［10，18］、玉米［9，19］、棉花［7，8］、水稻［6］、大豆［11，20］和菜心［21］等作物上均有报道.而油菜、芸芥和白芥的种皮和籽粒中因贮藏较多的脂肪、蛋白质、糖类等大分子干扰物质［14］，同时油菜籽中还含有黄酮、花色素苷、香豆素、鞣质等小分子次生物质，其中含有酚羟基的化合物，氧化后要与DNA结合，引起DNA降解.通过采用本试验方法，从三大类型油菜及其两种近缘植物的干种子中分离提取到了一定量的基因组DNA，且纯度较高.

3.2 本研究方法的优点

与其他从种子中提取DNA的方法相比，本试验方法主要有以下几点不同：（1）提取液中EDTA的浓度提高到50mmol/L，能保护种子内DNA 不被内源核酸酶降解，保证得到完整性较好的DNA；（2）种子和CTAB 提取液之间的质量体积比为0.5～700，不仅降低了多糖对提取DNA 的干扰作用，而且CTAB 与核酸复合物沉淀容易产生，得到的DNA不宜降解；（3）提取液中CTAB浓度提高到3×CTAB提取液，且在用乙醇沉淀DNA 时采用高盐法，使多糖保留在溶液中，有效除去种子中的多糖，使2.0＜OD260/OD230＜2.5，从而获得无多糖污染的DNA 样品；（4）提取液中加入1%的二硫苏糖醇和2%的PEG，不但起到防止酚类氧化的作用，还可防止酚类与DNA 的结合，完全保护DNA 的完整性；（5）本试验通过氯仿-异戊醇混合液对先后得到的上清液进行两次抽提，然后用预冷乙醇对上清液中的DNA 进行两次沉淀，能有效除去种子中贮藏的蛋白质，将蛋白质污染降到最低；（6）直接以油菜及其近缘植物干种子为材料进行DNA 提取，相比现有常用方法中以叶片为材料的提取方法，不仅简单快速，省去了育苗过程，在降低实验成本的同时大大降低了工作效率；（7）在适量提取液中研样，不需液氮中冷冻研样，也能防止DNA 的降解，避免了被液氮冻伤的危害.总之，采用本研究方法来提取DNA，可避免商业试剂盒在提取高质量DNA中所付出的昂贵代价，并且该方法不需要液氮和幼苗培养过程.

3.3 后续研究工作

本研究结果表明，当以油菜近缘植物白芥和芸芥为试材时，所得DNA样品液的浓度低于三大类型油菜的，其原因主要是材料本身的问题，芸芥和白芥的含油量低于油菜，但二者的种子中蛋白质、糖类的含量相对高于油菜的，导致DNA提取难度更大.另外，基因组靶向定位诱导损伤技术（Targeting In⁃duced Local Lesions In Genomes，TILLING）已经成为一种越来越受欢迎的可在已知基因序列的基础上鉴别突变系列的反向遗传学研究工具［22，23］，利用本研究方法提取的基因组DNA 能否胜任该技术对高丰度、高纯度DNA的严格要求还需作者进一步研究.