基于谱效关系探讨猫须草降尿酸物质基础*

陈佩琼，侯雪茜，许晨，张庆，朱春胜，李方

1.郑州市第九人民医院，河南 郑州 450000； 2.河南中医药大学，河南 郑州 450046； 3.郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450000

高尿酸血症是嘌呤代谢紊乱引起的慢性代谢疾病。随着含糖饮料、嘌呤及高蛋白类饮食的大量摄入，高尿酸血症的发病率呈逐年上升趋势[1-2]。大量流行病学调查亦表明，高尿酸血症不仅是慢性肾脏疾病和心血管疾病的独立危险因素，也与代谢紊乱，如糖尿病、肥胖和高血压等密切相关[3-5]。因此，开展高尿酸血症的预防和治疗具有重要意义。目前，临床中针对高尿酸血症的治疗，推荐一线用药为黄嘌呤氧化酶抑制剂药物如非布司他、别嘌醇，然而，上述药物在临床使用过程中常出现超敏、皮疹、斑丘疹等不良反应，限制了其临床使用[6-7]。因此，开发安全有效的降尿酸替代药物具有重要的意义。

猫须草为唇形科植物Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.WuexH.W.Li的全草，我国傣族民族医药称之为“雅糯秒”，已有悠久的使用历史。猫须草性甘、淡，味苦、凉，具有清热利湿，通淋排石之功效[8]。猫须草主要含黄酮类、酚酸类、二萜类、蒽醌类等成分[9-10]。现代药理研究表明，猫须草具有降尿酸、抗炎、镇痛、降血糖和免疫调节作用，临床主要用于治疗高尿酸血症、痛风、尿路结石、慢性肾炎等疾病[11-13]。然而，猫须草发挥降尿酸的物质基础尚未阐明，值得进一步深入研究。

中药谱效学由李戎等[14]在2002年提出，是在中医药理论研究基础上，以中药化学指纹图谱为基础，以药效学为主要研究内容，应用相应的数据处理方法，建立中药指纹图谱与中药疗效关系的一门学科。通过中药材化学指纹图谱信息与药效信息数据处理技术，筛选出与药效关系密切的化学成分峰，为阐明中药发挥药效的物质基础提供了新的研究思路[15-16]。与其他研究方法相比，谱效关系学具有高效、经济、环保等优点[17]。因此，本研究将结合谱效关系开展猫须草降尿酸物质基础研究，以期明晰猫须草发挥降尿酸药物的化学物质基础，同时亦为高尿酸血症的新药开发提供参考和借鉴。

1 仪器与材料

1.1 仪器安捷伦1290型高效液相色谱仪 (美国安捷伦科技有限公司)；Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm) 色谱柱(沃特世公司)；BS224S-型1/10万电子分析天平(德国赛多利斯公司)；贝克曼CX4 全自动生化分析仪，美国贝克曼公司。

1.2 试剂尿酸检测试剂盒(中生北控生物公司，生产批号：181391)，造模剂D-果糖(英国Amresco公司，生产批号：18G3056117)，水为屈臣氏纯净水，甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，生产批号：20200310)为质谱纯，甲醇(赛默飞世尔科技有效公司，生产批号：204132)为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.3 药材10批猫须草样品通过采集或购买获得，经郑州市第九人民医院李方副主任药师鉴定为唇形科植物猫须草的干燥全草，具体信息详见表1。

表1 10批不同产地猫须草信息表

1.4 实验动物清洁级SD雄性大鼠96只，体质量(200±20)g，购于河南省实验动物中心，许可证号为SCXK(豫)2015-0004。饲养于河南中医药大学动物实验中心，饲养条件为一级环境。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的配备取猫须草样品600 g，在高速粉碎机内粉碎，首次按照110比例加入蒸馏水，回流提取40 min，收集滤液；第二次按照17比例加入蒸馏水，回流提取30 min，合并上述滤液，浓缩至600 mL(1 g·mL-1)。同时，取上述粗提取液过 0.22 μm微孔滤膜过滤于液相瓶中，备用。其余9组提取方法同上。

2.2 UPLC指纹图谱的建立色谱条件：以 (体积分数)0.1%甲酸水溶液(A)-甲醇(B)为流动相进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～2 min，5%B；2～5 min，5%→25%B；5～10 min，25%B；10～16 min，25%→40%B；16～22 min，40%B；22～26 min，40%→55%B；26～30 min，55%→5%B；进样体积为 1.0 μL，柱温30 ℃，检测波长为323 nm。猫须草UPLC指纹图谱、对照指纹图谱见图1和图2，相对峰面积信息见表2。

2.3各产地猫须草降尿酸药效实验雄性SD大鼠按照体质量随机分为12组，每组8只，分别为正常组、模型组及模型组+给药组(10批不同产地猫须草水煎液)。正常组给予普通饮水，其余各组均给予体积分数10%D-果糖饮水复制大鼠高尿酸血症。各组均自由饮食、饮水，饲料和水每天更换1次，造模期间10批猫须草灌胃剂量折合原生药量为5 g·kg-1。实验周期为2周，于第二周眼眶取血，取血前禁食12 h(不禁水)，3 000 r·min-1，离心 10 min，离心半径13.5 cm，分离血清，检测各组大鼠血清尿酸含量，结果见表3。

降尿酸药效值=模型组血清尿酸值-各组血清尿酸值

图1 10批猫须草的UPLC叠加指纹图谱

图2 猫须草药材的对照指纹图谱

表2 不同产地猫须草共有峰面积信息表

表3 各产地猫须草降尿酸药效分析表

2.4 猫须草降尿酸谱效构建为阐明猫须草发挥降尿酸的活性成分，明晰猫须草指纹图谱中各共有峰与降尿酸药效之间的密切程度，本研究采用偏最小二乘法开展猫须草降尿酸的谱效构建，筛选出与降尿酸药效关系密切的共有峰。本实验采用SIMCA-P软件进行偏最小二乘法数据分析，首先建立一个自变量X对输出因变量Y影响的预测模型，R2Y和Q2接近1.0说明建模完美[18]。结果如图3所示，该模型93.7% Y变量的变化拥有87.1%的预测能力，说明该模型建立良好。

VIP反映的是自变量在解释因变量作用的重要程度，其中VIP>1时说明自变量在解释因变量时具有显著差异[17]。偏最小二乘法数据分析结果见图4和表4，其中共有峰5、9、3、8、2、7、6、1、10对降尿酸药效具有显著影响，而共有峰13、14、11、12、4、6对降尿酸药效影响不显著，初步表明猫须草降尿酸药效可能是共有峰5、9、3、8、2、7、6、1、10协同发挥。

图3 猫须草降尿酸模型拟合图

图4 各共有峰与降尿酸药效的VIP系数

表4 偏最小二乘法分析结果

2.5 猫须草共有峰指认采用电喷雾离子源(ESI)，离子扫描方式是正、负离子全扫描，正离子模式毛细管电压4.5 kV，负离子模式毛细管电压3.5 kV；氮气作为干燥气和雾化气，雾化温度为 200 ℃，雾化气压力0.8 bar，干燥气流速率 6.0 L·min-1；质量扫描范围为(m/z)100～1 000。其余条件同2.2项下，获得猫须草水煎液在正(A)、负离子(B)模式下的离子图，结果见图5。通过比对各共有峰的碎片离子信息，结合相关文献报道，对2.4项下筛选出的猫须草共有峰VIP值>1的特征峰进行初步指认，结果见表5。

注：A：正离子模式；B：负离子模式

表5 UPLC-MS猫须草特征峰指认表

3 讨论

近年来，我国学者对猫须草进行大量研究，陈旭洁等[25]比较了猫须草储存2年前后的化学成分和抗氧化能力，发现常规室温仓储2年内猫须草中多酚类及黄酮类化合物无显著变化，且抗氧化能力也未显著降低。陆应彩等[26]采用紫外分光光度法对不同产地猫须草进行了总黄酮含量测定，发现不同产地样品中总黄酮含量有差异。蓝伦礼等[27]采用HPLC法对15批不同产地的猫须草进行了指纹图谱及含量测定研究，发现云南西双版纳产的质量最佳。本研究采用体积分数10% D-果糖饮水复制大鼠高尿酸血症模型，同时开展了不同产地猫须草降尿酸药效实验，发现云南西双版纳地区采收时间8月份的猫须草降尿酸药效最佳，而河北安国的猫须草药效最弱。这可能是产地气候、海拔、光照、降雨量等因素影响猫须草有效成分的积累。

中药指纹图谱信息与药效信息需要通过一定的数据处理才能实现二者之间的联系，进而构建真正意义上的谱效关系。因此，选择适合的数据处理方法或者数学模型对谱效的有效构建至关重要。目前谱效数据还没有统一的处理方法，文献报道采用的数据处理方法主要有相关分析、灰色关联度分析、多元回归分析、偏最小二乘法分析等[28]，其中偏最小二乘法是集相关分析、主成分分析、多元线性回归为一体，且具有计算量小、预测精度高、无须剔除样本、易于定性解释等优点[29-31]，因此，本研究采用偏最小二乘法数据处理方法开展猫须草降尿酸的谱效构建。结果显示，猫须草UPLC指纹图谱中共有峰1、2、3、5、7、8、9、10在解释猫须草降尿酸药效时具有显著差异(VIP>1)，表明上述成分可能是猫须草发挥药效的等效组分群。

同时，本研究还结合UPLC-MS对上述峰进行了初步鉴定，结合相关文献报道，发现猫须草发挥降尿酸的化学成分可能与咖啡酸、香草醛、迷迭香酸等成分有关。孙影[32]在开展咖啡酸和迷迭香酸体外降尿酸活性筛查时发现，二者对黄嘌呤氧化酶均具有一定的抑制作用，且咖啡酸的抑制作用最强，其IC 50为2.82 g·L-1，进一步采用动物实验验证发现，咖啡酸具有显著的降尿酸药效，上述研究亦初步佐证了谱效构建筛选结果的合理性。而峰7、8、9结构还未明确，后期将采用高速逆流色谱技术对上述3个成分进行分离和富集，通过波谱数据分析以明确各成分的化学结构，同时对上述成分进行降尿酸药效验证，从而明晰猫须草发挥降尿酸药效的物质基础，为猫须草的质量评价提供参考，也为降尿酸新药的开发提供依据。