四川省主要粮食作物中镰刀菌毒素污染规律分析

陈新元，董 飞，仲伶俐，武德亮，王淑芳，徐剑宏，马桂珍*，史建荣，*

（1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏连云港 222005；2.江苏省农业科学院农产品质量安全与营养研究所/农业农村部农产品质量安全风险评估实验室（南京）/农业农村部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室/省部共建国家重点实验室培育基地-江苏省食品质量安全重点实验室/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，南京 210014；3.四川省农业科学院分析测试中心，成都 610066）

近年来，随着全球气候条件变化及耕作制度改变，主要由禾谷镰刀菌复合种（Fusarium graminearum species complex，FGSC）等侵染粮食作物引起的真菌病害在我国江淮及黄淮海地区频繁重发，不仅会造成粮食产量损失、品质降低，还会产生多种镰刀菌毒素（Fusarium toxins），严重威胁人畜健康[1-2]。其中，以脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）、3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-acetyldeoxynivalenol，3ADON）、15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-acetyldeoxynivalenol，15ADON）、雪腐镰刀菌烯醇（nivalenol，NIV）和镰刀菌烯醇（fusarenone X，4ANIV）等为主的单端孢霉烯族化合物（trichothecenes）是我国粮食作物产品中污染最为普遍的镰刀菌毒素[3-4]。单端孢霉烯族化合物是一类具有倍半萜类结构的毒素，已发现的种类超过200种[5]。单端孢霉烯族毒素能够抑制真核细胞蛋白质、DNA和RNA的合成，对造血系统和免疫系统都有很强的毒性，还可引起中枢神经系统紊乱、胃肠功能障碍、免疫功能和繁殖功能障碍等症状，具有致畸、致癌和致突变作用[6-7]。

Sun X.D.等[8]综述了我国玉米中真菌毒素污染现状，发现河南、四川、江苏和安徽等地玉米检出的镰刀菌毒素主要以DON为主。2019年Qiu J.B.等[9]分析了我国小麦镰刀菌毒素污染现状，发现江苏、安徽等地主要以DON和3ADON污染为主，河南、山东和河北等地以DON和15ADON污染为主，而四川和重庆等地以NIV和DON污染为主。Sun X.D.等[10]分析了我国水稻中真菌毒素污染现状，发现水稻样品中真菌毒素种类主要以黄曲霉毒素为主，以trichothecenes为主的镰刀菌毒素污染仅在广西地区有所报道。为保护国民健康、食品安全及产业发展，国内外已先后对谷物中的DON限量值进行了规定，GB 2761-2017《食品中真菌毒素限量》[11]规定谷物及其制品，具体涉及玉米、玉米面（渣、片）、小麦、大麦、麦片及小麦粉，其DON限量值为1 000 μg/kg。欧盟规定谷物、面粉及面包中DON限量分别为1 250、750 和 500 μg/kg[12]。

研究发现，不同种植制度对粮食作物中镰刀菌毒素，尤其是trichothecenes影响显著[13-14]。S.Vogelgsang等[15]报道在小麦-玉米轮作模式下，小麦中DON毒素含量较前茬玉米显著增加；J.N.Selvaraj等[16]调查了水稻-小麦、玉米-小麦、棉花-小麦及大豆-小麦等轮作方式对江淮地区小麦中镰刀菌毒素污染影响，发现水稻-小麦轮作方式下小麦中DON毒素污染水平最高，达到 4 899.3 μg/kg；Qiu J.B.等[17]比较江淮地区水稻-小麦及玉米-小麦轮作方式对小麦中镰刀菌毒素污染影响，同样发现水稻-小麦轮作方式下小麦中DON毒素污染水平显著高于玉米-小麦轮作的小麦。

四川省是我国粮食主产省之一，主要粮食作物种类包括玉米、小麦和水稻等，主要种植制度包括水稻-小麦轮作、玉米-小麦套作及水稻-再生稻等种植制度[18]。目前，国内关于四川省粮食作物中镰刀菌毒素污染报道相对较少[3-5]，种植制度对该地区粮食作物中镰刀菌毒素污染影响尚不明确。本文采用高效液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）对2019年四川省玉米、小麦及水稻样品中DON、3ADON、15ADON、NIV和4ANIV进行测定，分析种植制度对粮食作物产品镰刀菌毒素污染程度的影响，为四川粮食作物中镰刀菌毒素污染监管提供科学数据支撑。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂

试验所用仪器主要有Qtrap 6500 HPLC-MS/MS仪（美国AB SCIEX）、ME204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）、MS3 digital涡旋仪（德国IKA公司）、5810R离心机（德国Eppendorf公司）、振荡器DMT-2500（江苏天翎仪器有限公司）、N-WVAPTM 112氮吹仪（美国Organomation公司）、QuEChERS萃取包（上海安谱实验科技股份有限公司）、0.22 μm水相滤膜（天津津腾公司）、Milli-Q去离子水发生器（美国Millipore公司）。

DON、3ADON、15ADON、NIV和4ANIV标准品，纯度≥99%，ROMER国际贸易（北京）有限公司；甲醇（HPLC）、甲酸（HPLC），乙腈（HPLC），天津科密欧化学试剂有限公司。实验用水为Milli-Q超纯水，美国Millipore公司生产。

1.2 样品采集

根据四川省粮食作物种植情况，采用入户取样收集的方法，对2019年四川省绵阳、南充、德阳、资阳、内江、泸州和自贡等7个粮食主产区农户家中当年所收获的玉米、小麦及水稻样品进行随机取样。每份样品按真菌毒素含量控制取样法[19]采集2.0 kg，样品采集后及时密封，4℃保存。收集样品共311份，其中玉米86份、小麦103份、水稻122份，具体样品采集地区、种植方式及样品数量见表1。

表1 样品信息Table 1 Sample information

1.3 样品处理

1.3.1 样品制备

分别将玉米、小麦和水稻样品四分法缩减至少500 g，将样品粉碎至完全通过20目筛，混合均匀后装入样品密封袋中于-20℃避光保存，防止样品受污染和变质，以备用。

1.3.2 样品提取与净化

采用Dong F.等[20]报道的 QuEChERS方法对粮食作物样品进行提取与净化。准确称取均质样品5 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入20 mL的乙腈∶甲酸∶水溶液（体积比 80∶0.1∶19.9），振荡器2 500 r/min振荡30 min后加入QuEChERS萃取包，振荡器2 500 r/min振荡2 min使其全部分散。10 000 r/min离心5 min，取2 mL上清转移到玻璃试管中，于50℃水浴中氮气吹干，残留物加入1 mL乙腈∶水溶液（体积比1∶1）复溶，于涡旋混合器上振荡1 min，过0.22 μm有机滤膜于样品瓶中，供HPLCMS/MS检测。

1.4 分析条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；进样量 5 μL；柱温 35 ℃；流动相：A为水（含0.1%甲酸），B为甲醇，流速0.5 mL/min。梯度洗脱条件：0～2 min，流动相中水相（A）比例由90%下降至 50%；2～4 min，流动相中水相（A）比例由50%提升至 60%；4～5 min，流动相中水相（A）比例由60%上升至95%；5.0～8.0 min，保持流动相中水相（A）比例为 95%；8～10 min，流动相中水相（A）比例由95%下降至10%；10～15 min，保持流动相中水相（A）比例为10%。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）；扫描方式：正负离子模式同时扫描；检测方式：多反应监测模式；离子源温度600℃；驻留时间100ms；雾化气（氮气）压55psi；辅助气（氮气）压60psi；喷雾电压5 500 V；碰撞室射出电压6 V。镰刀菌毒素质谱参数见表2。

表2 镰刀菌毒素质谱参数Table 2 HPLC-MS/MS parameters for Fusarium toxins

1.4.3 基质标准曲线

准确称取5.0 g（精确到0.01 g）未检出镰刀菌毒素的不同空白粮食样品于50 mL离心管中，按1.3操作进行样品制备、提取及净化，将5种镰刀菌毒素标准混合储备液稀释配制成混合标准溶液，DON、3ADON、15ADON 和 4ANIV 标 定 为 10、50、200、500 和 1 000 μg/L；NIV 标定为 20、100、500、1 000和2 000 μg/L的系列标准工作液。

1.4.4 方法的回收率

采用本研究建立的方法对添加5种镰刀菌毒素的粮食样品进行检测，分别在3种粮食作物中添加DON、3ADON、15ADON、NIV 和 4ANIV 使 其 达 到20、200和 1 000 μg/kg，每个添加量重复 6次，测定方法回收率和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.5 数据分析

采用Excel 2016软件对数据进行处理，数据以平均值±标准误（standard error，SE）表示。采用SPSS 16.0统计分析软件，单因素方差分析及非参数检验Mann-Whitney U法检验处理间差异显著性。

2 结果与分析

2.1 检出限、定量限及回收率

以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）作线性回归方程，根据3倍信噪比的峰响应值得到方法的检出限，根据10倍信噪比的峰响应值得到线性范围的下限。DON、3ADON、15ADON和4ANIV的检出限为 3 μg/kg，定量限为 10 μg/kg；NIV 检出限为5 μg/kg，定量限为 20 μg/kg。DON、3ADON、15ADON、NIV和4ANIV在玉米、小麦和水稻中回收率为80.9%～97.2%，相对标准偏差为4.2%～8.8%（表3）；符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范基本信息食品理化检测》中的相关要求[21]。

表3 不同粮食作物中镰刀菌毒素检测回收率(n=6)Table 3 Recovery of Fusarium toxins in cereals(n=6)

2.2 四川省粮食作物样品中镰刀菌毒素污染水平

通过对2019年四川省粮食作物中5种镰刀菌毒素污染检测发现（表4），该地区粮食样品中镰刀菌毒素污染种类以NIV为主，检出率达到70.7%；NIV平均含量为（497±82.1）μg/kg，显著高于3ADON、15ADON 和 4ANIV（P＜0.05），但与 DON 没有显著差异（P＞0.05）。

表4 四川省粮食作物样品镰刀菌毒素污染总体情况Table 4 Contamination of Fusarium toxins in cereals

2.3 不同粮食作物样品中镰刀菌毒素污染水平

比较2019年四川省不同粮食作物中镰刀菌毒素污染种类发现（表5），玉米中3ADON未检出，DON和NIV检出率分别为44.2%和37.2%；小麦样品中5种镰刀菌毒素均有检出，其中NIV检出率最高达96.1%，DON次之（78.6%）；水稻中3ADON和15ADON均未检出，NIV检出率最高达59.1%，DON仅有3个样品检出。比较不同粮食作物中单端孢霉烯族化合物（DON+3ADON+15ADON+NIV+4ANIV，trichothecenes）污染程度发现，小麦样品中trichothecenes含量达（1 190±22.5）μg/kg，显著高于玉米及水稻样品（P＜0.05）。

表5 不同粮食作物样品中镰刀菌毒素污染情况Table 5 Contamination of Fusarium toxins in different cereals

2.4 不同取样地区粮食作物样品中镰刀菌毒素污染水平

比较不同取样地区粮食作物样品中镰刀菌毒素检出情况发现（表6）：DON主要存在于小麦和玉米样品中，仅在内江地区3个水稻样品中检出DON毒素；NIV毒素在所有取样地区均有检出，且小麦中NIV检出率高于玉米及水稻样品。比较同一地区粮食作物样品中镰刀菌毒素污染程度发现：绵阳、德阳和资阳地区小麦中tirchothecenes含量分别为3 990.3、1 580.3 和 1 102.1 μg/kg，显著高于当地的玉米及水稻样品（P＜0.05）。比较不同取样地区粮食作物样品中镰刀菌毒素污染程度发现：绵阳、德阳及资阳小麦中tirchothecenes含量显著高于其他地区的小麦、玉米及水稻样品；除绵阳、德阳及资阳外其他主产区的小麦、玉米及水稻中tirchothecenes含量没有显著差异（P＞0.05）。

2.5 种植制度对粮食产品中镰刀菌毒素污染影响

比较同一种植制度下不同作物中镰刀菌毒素污染程度（表7）：玉米-小麦套作方式下，小麦样品中镰刀菌毒素污染种类、检出频率均高于玉米样品，小麦样品中trichothecenes含量显著高于玉米样品（P＜0.05）；水稻-小麦轮作方式下，小麦样品中镰刀菌毒素污染种类、检出频率均高于水稻样品，水稻中DON及其乙酰化衍生物均未检出，小麦样品中trichothecenes含量显著高于前茬水稻样品（P＜0.05）；水稻-再生稻种植方式下，水稻及再生稻样品中镰刀菌毒素种类均以NIV和4ANIV为主，再生稻样品中NIV和4ANIV检出率高于上一季水稻样品，再生稻样品中trichothecenes含量显著高于水稻样品（P＜0.05）。比较不同种植制度下镰刀菌毒素污染情况：水稻-小麦轮作方式下小麦样品中trichothecene含量显著高于玉米-小麦套作的小麦样品（P＜0.05）；水稻-小麦轮作下水稻中trichothecenes含量显著高于水稻-再生稻种植方式下第一季水稻样品（P＜0.05），与再生稻样品中trichothecenes含量没有显著差异（P＞0.05）。

表7 不同种植制度下粮食作物样品中镰刀菌毒素污染水平Table 7 Concentration levels of Fusarium toxins in cereals from different planting systems

3 讨论

本研究对2019年四川省311份粮食样品中DON、3ADON、15ADON、NIV 和 4ANIV 等 5种镰刀菌毒素污染规律分析发现，取样地区粮食作物中镰刀菌毒素污染种类以NIV为主，DON次之，NIV和DON平均含量显著高于3ADON、15ADON及4ANIV（P＜0.05），不同取样地区与粮食作物之间trichothecenes污染程度存在差异。尽管NIV在肠道毒性、细胞毒性等方面显著高于DON[22-23]，但是国内目前还没有制定粮食作物产品中NIV毒素的相关限量标准，应该予以高度关注。

Sun X.D.等[8]综述了我国玉米中镰刀菌毒素污染现状，发现河南、四川、江苏和安徽等地玉米中检出的trichothecenes主要以DON为主。与之类似，2019年四川省玉米样品中trichothecenes检出种类同样以DON为主。但与Sun X.D.等[8]综述结果不同的是，2019年四川省玉米样品中NIV毒素含量明显高于DON。Qiu J.B.等[9]综述了我国小麦镰刀菌毒素污染现状，发现我国长江中下游地区小麦中trichothecenes检出种类主要以DON为主，而在四川、重庆等地区以NIV为主。本研究结果与其一致，2019年四川省小麦trichothecenes污染同样以NIV为主，NIV毒素含量显著高于DON（P＜0.05）。Sun X.D.等[10]分析了我国水稻中真菌毒素污染现状，发现水稻样品中真菌毒素种类主要以黄曲霉毒素为主，以DON和NIV为主的镰刀菌毒素污染仅在广西地区有所报道。Dong F.等[24]分析江苏省水稻样品中镰刀菌毒素污染状况时发现，江苏地区trichothecenes污染种类主要以DON为主。尽管四川是我国最为重要的水稻产区之一[25]，但在水稻中镰刀菌毒素污染规律研究报道相对较少[10]。本研究首次对四川省水稻样品中镰刀菌毒素进行检测分析，结果发现取样地区水稻trichothecenes污染主要为NIV，仅有3个样品检出DON。

研究发现，水稻-小麦轮作方式下小麦中镰刀菌毒素污染水平显著高于玉米-小麦、大豆-小麦及棉花小麦等轮作方式下的小麦样品[13，17]。本研究结果与前人一致，四川地区水稻-小麦轮作方式下的小麦样品中trichothecenes含量显著高于玉米-小麦套作方式下小麦样品（P＜0.05）。四川作为西南地区典型的再生稻产区，再生稻对水稻产量增加、水稻经济效益提升等方面发挥了重要作用[26]，但水稻-再生稻种植方式对水稻中镰刀菌毒素污染影响的研究国内外未见报道。本研究在掌握四川地区主要粮食作物中镰刀菌毒素污染规律基础上，首次分析了水稻-再生稻种植方式对水稻中镰刀菌毒素污染的影响，发现水稻-再生稻种植方式会显著增加再生稻中trichothecenes含量（P＜0.05）。总体而言，四川省小麦、玉米和水稻主要毒素污染种类为NIV毒素；通过适当调整取样地区主要粮食作物的种植制度，如减少水稻-小麦轮作或再生稻种植面积，将有助于四川省主要粮食作物中镰刀菌毒素的污染控制。