复方中草药制剂对鸡滑液支原体病的治疗效果

刘 凡，郭 磊，陈秀红，边海霞，郭亚男，姜肖军，何生虎*

(1.宁夏大学农学院，宁夏银川 750021；2.宁夏晓鸣农牧股份有限公司，宁夏银川 750021)

鸡滑液支原体(Mycoplasmasynoviae，MS)是可以引起鸡亚临床型上呼吸道感染的一种重要禽类病原体[1]。鸡滑液支原体病又名鸡滑液支原体感染，是由MS引起的鸡、鸭等禽类一种以关节有脓性渗出物的滑膜炎、腱鞘炎、关节肿大及跛足为主要特征的禽类传染病。鸡群感染后会出现明显的精神沉郁、喜卧，肉鸡主要表现为生长缓慢、饲料转化率低，蛋鸡则会出现产蛋率、蛋品质和孵化率下降，且在多项研究中表明，鸡滑液支原体病还会与禽流感、新城疫病毒和大肠埃希氏菌等在致病力方面有协同作用，导致鸡群死淘率增加，给家禽养殖行业造成严重的经济损失[2-4]。

从2010年我国南方最先发生此病开始，短短数年时间MS就已经成为影响我国家禽养殖业健康发展的最重要疫病之一。国内外关于鸡滑液支原体病的预防治疗方案也多以疫苗免疫和抗生素治疗为主，但有研究结果显示，抗生素药物和灭活疫苗免疫的联合保护率最好也仅达到80%[5]。防控MS传染性疫病最好方案是疫病净化，其次是疫苗免疫与药物治疗。然而MS的传染性强且传播途径广泛，不仅可以发生水平传播还可以发生垂直传播。近年来，全国各地都存在MS感染，从流行情况、饲养环境、从业人员水平等多方面而言，净化的解决方案在我国现阶段执行难度过大。同时MS易产生耐药性，和细菌相比基因组较小但其某些基因的转换表达会产生很大的抗原变异。现依旧仅有澳大利亚等少数国家有MS温度敏感型活疫苗的商品应用[6]，而国内的研究学者石晓磊等[7]研究发现 MS活疫苗无法保护已感染的鸡群，在免疫后反而会造成更大的经济损失,这也可能是MS疫苗免疫效果不理想难以防控的重要因素[8]，更是MS仅仅数年内就对我国的家禽养殖行业造成了巨大损失的一个重要原因。

在早期报道的MS体外抗菌药物敏感试验中，MS对四环素类、大环内酯类抗生素及喹诺酮类抗菌药物敏感[9-10]，药物治疗可以有效降低MS通过蛋传播，还可以一定程度改善蛋品质[11]。然而，随着抗生素的广泛使用和滥用，MS对抗生素的耐药程度也是逐年升高，而治疗效果每况愈下。自2006年起，许多国家就开始禁止使用抗生素作为生长促进剂，抵制在家禽饲料中添加抗生素产品[12]。同时，早在2017年6月22日我国农业农村部为应对动物源细菌耐药挑战，提高兽用抗菌药物科学管理水平，制定了《全国遏制动物源细菌耐药行动计划(2017-2020年)》，更加严格的限制了抗生素的使用。次年8月，我国又首次发现非洲猪瘟，自疫情发生以来，生猪饲养量急剧下降，肉类供求关系一度出现失衡。家禽因饲养周期短、饲养成本低等特点，禽类动物产品迅速成为了生猪产品的替代者，造成我国市场对禽类肉品和禽蛋的需求大大增加。MS作为目前影响我国家禽饲养最重要是疫病之一，其防控治疗就显得尤为重要。

中草药作为我国医药史上的一块瑰宝，有着许多得天独厚的优越条件。中草药本身属于植物，是一种既无抗药性和耐药性,也无药害残留、无污染的一类天然产品,具有抗病保健、抗毒素、提高机体免疫力和生产性能、调整胃肠机能等特点[13]。近年来，中药在许多动物疾病治疗中做出了很大贡献。一些国内研究者在此方面做了大量工作，王春元等[14]研究表明，中药果根素对鸡毒支原体有治疗效果，但还未发现中药对鸡滑液支原体病治疗的相关报道。本试验依据中兽医理论及所在实验室中药治疗动物疫病的研究基础，结合鸡滑液支原体临床症状和病理特征，选取大黄、黄连、金银花等8味中草药混合制成超微粉对鸡滑液支原体病鸡进行治疗，探究中药对鸡滑液支原体病的治疗效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 大黄、黄连、金银花、车前子、党参等8味中药，购自亳州金勺堂中药饮片有限公司。

1.1.2 试验动物及菌株 30只鸡滑液支原体血清学抗体检测为阴性的28日龄海兰褐雏鸡，由宁夏某蛋鸡孵化公司提供；鸡滑液支原体分离株G-52为攻毒株，由宁夏大学农学院临床兽医实验室提供。

1.1.3 主要试剂 改良的Frey氏固、液培养基，北京中海生物科技有限公司产品；IDEXX鸡滑液支原体抗体的酶免疫检测试剂盒，美国爱德士生物科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 恒温摇床(QYC-200)，上海福玛实验设备有限公司产品；PCR扩增仪 S1000，Thermal Cycler伯乐公司产品；凝胶成像仪(Universal Hood II)，BIO-RAD公司产品；酶标仪(scientific MULTLISKAN MK3)，赛默飞世尔科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 鸡滑液支原体病病理模型的建立 将实验室保存的鸡滑液支原体分离株G-52经改良的Frey液体培养基复苏后传代培养，菌液浓度达到1×108CCU/mL，作为接种菌液。30只28日龄雏鸡随机分为治疗组、阳性对照组(以下简称对照组)和空白组3组，10只/组。治疗组和对照组通过鼻腔滴入菌液攻毒，进行病理模型的复制，剂量按0.5 mL/只/d,连续攻毒3 d[2,7]，空白组按0.5 mL/只/d剂量生理盐水做相同处理，连续3 d。

1.2.2 临床观察 攻毒后每天观察各组鸡群采食、饮水量、精神状态及肢体等情况，隔天记录鸡群体温，每隔7 d记录鸡只体重、翅下静脉采血分离血清。

1.2.3 中药制备 将配伍组方的8种中药按不同份额配比进行超微粉碎，粒径在15～20目混匀备用。

1.2.4 中药治疗试验 治疗组和对照组鸡群在鸡滑液支原体病病理模型建立的第21 天(雏鸡49日龄)时，鸡群整体羽毛蓬松，喜卧、精神沉郁采食量降低、眼睑肿胀、关节肿大站立不稳。出现临床症状后对试验组进行复方中药治疗，每天早晚各投喂1次，每次1 g/只,连续投喂7 d。中药治疗后观察7 d。

1.2.5 病理剖检对比 试验第35 天(雏鸡64日龄)分别对治疗组、对照组和空白组鸡进行解剖检查，观察鸡内脏组织器官的病理变化。

1.2.6 病原分离验证 第35 天采集各组鸡咽拭子、跗关节内脓性分泌物分别接种MS固体和液体培养基中，在固体培养基看菌落生长情况。在液体培养基按1∶10倍接种，37℃培养2 d后，取3 mL培养液,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA进行PCR扩增，利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的MS通用引物中鸡滑液囊支原体的基因序列(MS-F:5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′；MS-R:5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′)合成引物进行扩增，扩增产物经过凝胶电泳分析后观察扩增的特异性目的片段[15]。

1.2.7 抗体水平检测 按说明书方法将采集的血清进行滑液囊支原体抗体检测，计算S/P值(S/P≥0.5为阳性；S/P<0.5为阴性)判断MS抗体的水平。

1.2.8 统计分析 不同组的鸡群体温、体重和抗体水平检测结果采用SAS 8.2软件、Graphpad Prism 8和EXCEL软件进行统计学分析。

2 结果

2.1 体温变化

治疗组和对照组通过菌液滴鼻感染攻毒后整体出现体温升高的情况(图1)，在试验第21天对治疗组鸡进行中药治疗后虽然未恢复到与空白组统一水平，但鸡群体温有逐步下降趋势。

图1 试验阶段各个组鸡体温变化趋势

2.2 体重变化

每隔7 d对各组鸡称重直至试验结束，计算平均增重情况。结果表明，治疗组和对照组在人工感染后，鸡群平均净重均低于空白组，随着周龄增加，治疗组对照组与空白组体重差异越来越大。采用Excel建立数据库，用SAS软件进行统计分析，结果以平均值±标准差表示，自42日龄后直至试验结束，治疗组对照组与空白组的体重差异显著(P<0.05)，但在49日龄进行治疗1周后，治疗组增重明显高于对照组(P<0.05)，具体结果见表1。

表1 试验各组鸡体重的变化

2.3 抗体水平变化

攻毒感染前对3组鸡采血分离血清，检测MS抗体水平为阴性，随后每隔7 d对各组鸡采血分离血清，检测MS抗体水平，直至试验结束，计算S/P值(S/P≥0.5为阳性)，判断鸡群感染MS情况。结果表明，治疗组和对照组在人工感染鸡滑液支原体后，鸡群抗体水平S/P值明显升高，MS抗体水平有显著升高。空白组因未进行攻毒感染试验，抗体水平检测一直保持阴性。

图2 试验各组鸡MS抗体水平变化图

2.4 临床症状

空白组鸡从试验开始到结束整个过程中未出现任何异常情况，精神状态良好，饮水采食都一直保持正常。治疗组和对照组鸡在攻毒后第8 天(雏鸡37日龄)出现呆滞喜卧，采食量减少，鸡冠颜色变浅，在攻毒后第15 天出现关节红肿，不愿站立、行动缓慢，鸡冠肉髯苍白，个别鸡出现张口呼吸和呼噜声。在攻毒后第20 天，治疗组和对照组鸡全部出现精神沉郁，羽毛松乱，鸡跗关节肿胀，按压有波动感，个别鸡出现行动障碍。

2.5 中药治疗结果

人工感染MS后，治疗组在攻毒后第21 天开始通过口服方式投喂复方中药进行治疗，经过7 d治疗后，鸡冠颜色由苍白色转为红色，精神状态活泼，采食量有所提高，站立不稳的症状消失。对照组没有进行任何治疗，在攻毒后第22天有1只鸡发生死亡，结果见表2。

表2 复方中药对鸡滑液支原体病治疗效果

2.6 剖检结果

剖检可见治疗组和对照组鸡均存在严重消瘦情况，胸背部肌肉萎缩、龙骨突出。对照组有轻微弯曲症状，鸡趾附关节肿胀，滑膜组织关节液有脓性渗出物，渗出物呈黏液状，气管出现环状出血，肝脏轻微肿大，颜色发黄、质脆边缘变钝。治疗组关节液清亮、肝脏颜色鲜红，边界清晰，其他组织脏器均未见明显病理特征。

2.7 病原分离验证

对采集的治疗组、对照组和空白组的关节液进行分离培养，本文参照周云峰等[16]、羊扬等[17]研究方法，利用GenBank中收录的鸡滑液支原体WVU 1853(ATCC 25204)株(GenBank登陆号：N-R044811)VlhA基因序列合成引物进行扩增，以实验室收藏菌株为阳性对照，有效率阳性对照与对照组产物均得217 bp大小的片段(图3)。

1.DNA标准DL 2 000；2.治疗组；3.空白组；4.对照组；5.阴性对照；6.阳性对照

3 讨论

通过分析本试验过程中各组鸡体温、体重、临床症状、病理变化、复方中药治疗的效果、病原分离验证等，验证了复方中草药制剂对鸡滑液支原体病有确切的治疗效果。试验首先成功复制出鸡感染滑液支原体病的动物模型，试验结果与张鑫等[2]和丁美娟等[18]两组人工感染复制的病理模型有高度一致性，发病鸡临床症状鸡冠苍白，跛行、采食量下降，鸡群出现羽毛粗乱，大部分鸡关节、爪塾肿胀。人工感染3周后(雏鸡42日龄)，试验组体重(545.4 g±14.93 g)和对照组体重(546.4 g±15.47 g)与空白组鸡体重(574.5 g±11.91 g)出现差异显著情况，说明鸡滑液支原体病鸡会影响采食，甚至降低饲料转化率，从而会降低鸡增重速度。中药治疗1周后，试验组平均体温下降趋势明显，基本与空白组体温一致。用中药治疗后试验组鸡群平均增重的提高明显优于对照组，试验过程体温变化、平均增重与张鑫等[2]和丁美娟等[5]对禽滑液支原体相关研究的结果一致。

整个试验过程中，雏鸡未进行过鸡滑液支原体的疫苗免疫，治疗组和对照组仅进行了鸡滑液支原体菌株的攻毒处理后，血清样品S/P值大于0.5判定为抗体阳性且持续增高，说明治疗组和对照组鸡群MS抗体水平一直在上升，存在鸡滑液支原体感染。治疗组配合中药治疗后抗体水平有所下降，原因可能是治疗后病原刺激减弱从而影响了抗体水平的升高；对照组因为没有进行治疗，抗体一直保持较高水平；空白组鸡除未进行攻毒试验，其他饲养条件均不变，一直保持MS血清学抗体检测阴性，进一步验证了病理模型复制的成功，也为试验有效性做了进一步支撑。

在病理剖检过程中，试验组经过治疗后剖检未发现关节有渗出物且肝脏呈红棕色，对照组鸡关节肿大且有黏稠黄色渗出物，肝脏呈现土黄色，后期MS的病原分离检测中，试验组也未分离检测到MS病原，对照组分离检测到MS病原，从临床治疗检验的角度都说明了中药确实对鸡滑液支原体病有良好的治疗效果。治疗试验组体温下降、体重增加且剖检未发现明显病理变化，主要是复方中药中有凉血解毒、清热燥湿等功效药物，同时还有补中益气、健脾益肺等功能性药物补充，使得试验组鸡群发热情况得到有效控制，临床指征也有了明显改观。试验结果表明，复方中草药制剂对鸡滑液支原体病治疗具有可靠性和应用价值。

本试验结合中兽医理论指导特意选择的8种中药，大多具有抗菌消炎和增强机体免疫作用，对鸡滑液支原体临床症状有选择性和针对性治疗效果[19]，组成的复方制剂进行鸡滑液支原体病的实验室治疗，表观的临床有效率达100%，从病原学的角度，在治愈后的试验鸡也未分离出鸡滑液支原体病原，治疗效果达到了预期试验效果，虽然复方中药治疗的内在机制还有待进一步探讨，中药治疗的效果与抗生素治疗的效果未进行相关的对比试验，但对实际生产中鸡滑液支原体病的防控提供了新的思路，尤其是为感染发病后鸡群的治疗提供了参考。