沙拉沙星环糊精包合物的制备与体外释放度研究

姜兴粲，李 冰，张继瑜

(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室,甘肃兰州 730050)

沙拉沙星(sarafloxacin,SAR)是继恩诺沙星之后又一新的动物专用药，对多种细菌均有较强抑杀作用，是临床上常用的广谱抗菌药。为提高沙拉沙星的溶解度，可用环糊精(cyclodextrin,CD)做辅料制成包合物制剂。环糊精包合物微胶囊是通过分子间弱相互作用形成的主客分子体系，是提高难溶性药物溶解度和生物利用度的一种有效技术[1-8]。环糊精是一种环状低聚糖，呈截短的锥形，可以在不同程度上包裹具有适当分子尺寸和极性的疏水性药物分子。这种包合物可以提高药物的化学稳定性、膜渗透性和生物利用度。这项技术已经证明可以改善多种药物的溶解度和溶出度，如紫杉醇包合物制剂[1-7]。常用的环糊精有α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，它们分别由6个、7个和8个葡萄糖单元组成。β-环糊精(β-cyclodextrins，β-CD)及其衍生物是药物制剂中常用的主要赋形剂[1-8]。

响应面方法(Response surface method，RSM)用于建立经验模型，可通过统计预测将所需的实验次数减到最少，还用于研究多个单因素之间的交互作用。优化沙拉沙星/β-环糊精(SAR/β-CD)包合物制备条件的常规方法是通过单因素试验进行的，每次考察一个因素，既费时又不能预测不同条件下的结果,所以需要利用一定的数学技术来设计试验[9-12]。近年来，RSM已被用于许多生物技术过程，包括培养条件的优化和酶的生产。目前，关于其微胶囊制备的报道很少[9-12]。本文采用RSM优化制备工艺来获得更精确的试验结果，并对制备的沙拉沙星/β-环糊精(SAR/β-CD)包合物进行表征和粒度测定以及体外释放度研究，以期为沙拉沙星的应用提供参考。

1 材料及方法

1.1 药品

沙拉沙星(分子量385.3 g/moL，含量>98%，批号20171022)，广州杨叶生物科技有限公司产品；β-环糊精(β-CD，分子量1 135 g/moL，批号20171216)，上海源叶生物科技有限公司产品；沙拉沙星粉剂(批号20180311)，安徽奥力欣生物科技有限公司产品；甲醇(99.98%，批号20171227)，Fisher Chemical公司产品；所有使用的试剂均为AR级。

1.2 主要仪器

溶出仪(USPII型)，PHARMA公司产品；冷冻干燥机(RV8型)，Edwards有限公司产品；高效液相分析系统(1290InfinityП型)，安捷伦科技有限公司产品；扫描电子显微镜(JSM-6701型)，日本电子光学有限公司产品；粒度分析仪(Mastersizer 2000型)，Malven Instruments科技有限公司产品。

1.3 SAR/β-CD包合微胶囊的制备

1.3.1 响应面法优化制备工艺 采用响应面法(RSM)中的Box-Behnken设计法优化微胶囊的制备条件，利用RSM分别建立3个模型，根据综合评分的响应值来优化微胶囊的制备条件。这些模型可以为制备工艺提供更可靠的预测数据，从而获得所需的目标包合物微胶囊。用响应面分析法研究了微胶囊包合率伴随温度、搅拌速度和搅拌时间的变化[1-5,13-14]。采用3因素3水平设计的响应面模型研究自变量的影响：搅拌时间(x1)从3 h到5 h；温度(x2)从40℃到60℃；搅拌速度(x3)从200 r/min到400 r/min[16]。3个实验参数的指代意义见表1所示。

表1 总结

1.3.2 评分标准 综合评分总分100分，搅拌时间分别为3 h、4 h和5 h，总分为9分，占比9%，搅拌时间评分标准：5 h，得3分；4 h，得6分；3 h，得9分。转速分别为200 r/min、300 r/min和400 r/min，总分9分，占比9%。转速评分标准为400 r/min，3分；转速为300 r/min，6分；转速为200 r/min，9分。搅拌温度分别为40℃、50℃和60℃，总分为9分，占比9%。搅拌温度评分标准为60℃，得3分；50℃，得6分；40℃，得9分。在同一处方中，当原料药与β-环糊精的摩尔比相同时，每克包合物微囊中原药含量越高，包合率越高[5,14,17-18]。

包合率=(包合物中SAR质量/添加的SAR质量)×100%

包合率反映了β-环糊精对沙拉沙星的包埋效果，总分73分，占比73%。包合率评分标准为包合率<70%，得24分；70%<包合率<90%，得48分；90%<包合率，得73分[6,7,20-23]。

1.4 冷冻干燥

将完成包合作用后的溶液放入-80℃的冰箱中冷冻过夜，然后迅速放入冷冻干燥机中，干燥48 h后取出[24]。

1.5 HPLC实验验证

将参比物质称量适量，用0.1 moL/L氢氧化钠溶液溶解，放入容量为50 mL的容量瓶中，加入流动相定容，制成沙拉沙星的质量浓度为0.099 4 g/L的参比溶液。制备质量浓度分别为9.94、19.88、29.82、39.76、49.70、59.64、69.58、79.52和89.46 mg/L的一系列参比溶液，用于液相色谱测定。以峰面积(y，MAU*s)为纵向坐标，以SAR质量浓度(x，μg/mL)为横坐标进行线性回归。回收率实验分别制备不同浓度的参比溶液(n=6)，过滤后注入液相色谱仪。

1.6 扫描电子显微镜(SEM)

使用双面胶带分别将SAR、β-CD和SAR/β-CD包合物及物理混合物样品粉末预先固定在黄铜短管上并通过薄金涂层导电，在5.0 kV工作电压下观察样品形态[8,25,26]。

1.7 粒径检测

将SAR/β-CD包合物微囊与10 mL蒸馏水在25℃下混合制备样品悬浮液，进行SAR/β-CD包合微胶囊的粒度大小分布测定，样品一式3份[27]。

1.8 体外溶出度研究

在50 r/min的转速下，溶出介质(pH 7.4的PBS缓冲液)900 mL中对物理混合物、SAR普通粉剂和SAR/β-CD包合物微囊进行体外溶出度实验。以预定的时间间隔(0、5、10、15、25、30、35、45、50、60、80、100、130、160和190 min)取样，然后用新鲜溶解介质替换。用验证的HPLC方法在280 nm处对溶出样品进行分析[7,13,21-23]。

2 结果

2.1 HPLC条件

色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm，5 μm)，柱温30℃，流动相为乙腈-2%四丁基溴化铵(13∶87，v/v)体系，检测波长280 nm，进样量：5 μL。标准曲线的线性方程为y(MAU*s)=34.66x(μg/mL)-15.867，检测限为0.004 μg/mL(S/N≥3)，定量限为0.066 μg/mL(S/N≥10)，其中y为SAR的峰面积，x为SAR的质量浓度。高浓度(89.46 μg/mL)、中浓度(59.64 μg/mL)和低浓度(29.82 μg/mL)的平均回收率分别为100.21%、99.17%和101.67%，此方法高效可行。

2.2 响应面优化结果

由表2中的数据及多次实验筛选验证得到的最佳制备工艺参数为沙拉沙星(0.01 moL)和β-环糊精(0.02 moL)混合液以300 r/min的搅拌速度，在50℃温度下搅拌4 h。由响应面综合评分测试和回归方差分析(表2和表3)显示，温度(x1)、速度(x2)和时间(x3)具有显著性差异(P<0.05)，图1 为各个变量与综合评分的3D响应面和等高线图，与表3中的回归方差分析相互印证。

a，b.速度和时间；c，d.速度和温度；e，f.温度和时间

表2 响应面测试表

表3 包合过程回归方差分析

2.3 包合率测定结果

结果表明，沙拉沙星/β-环糊精包合物的平均包合率为90.33%(表4)，β-CD对SAR产生了良好的包合效果，既符合《中国兽药典》(2015版)的规定也满足了生产和应用的要求。

表4 包合率

2.4 扫描电镜表征结果

结果显示，纯沙拉沙星呈现出大小不同的小颗粒，如图2(C)；β-环糊精显示不规则颗粒聚集，见图2(B)；物理混合物与原药自由分子晶体有一些相似之处，显示了两种晶体组成，见图2(A)；SAR/β-CD包合物微胶囊呈现为致密均匀的块状结构，包合作用后两种成分的原始形态消失了，它不同于β-环糊精和沙拉沙星的大小和形状，如图2(D)所示。

图2 物理混合物(A)、β-CD(B)、SAR(C)和包合物微囊(D)的扫描电镜图像

2.5 粒径检测结果

粒径检测结果表明，制备的3份SAR/β-CD包合微胶囊的平均粒径约为1.0 μm(图3)，分布均匀且相对集中，符合《中国兽药典》(2015版)的规定。

图3 粒度检测

2.6 体外释药规律

沙拉沙星和β-环糊精的物理混合物、沙拉沙星普通粉剂和沙拉沙星/β-环糊精包合物微囊的溶出曲线如图4所示。在PBS缓冲液中SAR/β-CD包合物微囊的累积溶出度明显高于物理混合物和沙拉沙星粉剂。对于SAR/β-CD包合物，在前5 min累积溶出度超过60%，60 min后累积溶出度达到97%左右并保持稳定，而对于沙拉沙星和β-环糊精的物理混合物，前5 min累积溶出度仅为34.1%，60 min后累积溶出度达到63%左右并保持稳定。而沙拉沙星粉剂在前5 min的累积溶出率仅为51.9%，60 min后累积溶出率达到74.4%左右并保持稳定。

图4 SAR/β-CD包合物微囊(●)、粉末(▲)和物理混合物(■)的体外释放度

3 讨论

本研究采用响应面法优化了沙拉沙星/β-环糊精包合物的制备方法[10-12]，优化后的条件为SAR(0.01 moL)和β-CD(0.02 moL)混合液以300 r/min的转速，在50℃下搅拌4 h，此工艺安全、高效，对环境无污染。扫描电子显微镜表征实验呈现出沙拉沙星/β-环糊精包合物不同于原药和辅料的形貌，证明了SAR/β-CD包合物微囊的形成[4-8]。粒径试验表明，水溶液中SAR/β-CD包合物微囊的平均粒径为1.0 μm且呈正态分布，与张良珂对柚皮素的磺基丁醚-β-环糊精/壳聚糖纳米粒子的研究结论一致[27]。在响应面法优化后的参数下，沙拉沙星/β-环糊精包合物的平均包合率为90.33%，可以满足工业生产与临床使用的要求。以pH 7.4的PBS缓冲液为溶出介质的体外溶出试验表明，SAR/β-CD包合物微囊的累计溶出率为97%，明显高于物理混合物和沙拉沙星普通粉剂63%和74%的溶出率，这与同类制剂研究中纳雷什·德瓦萨里对厄洛替尼与磺丁基醚-环糊精包合物的研究[22]和阿努拉格·洛达卡对氯硝柳胺-环糊精包合物的研究[28]取得了相似的结论,文中累积溶出量按标示量计算结果不低于规定限度，符合《中国兽药典》(2015版)的规定。目前，上市的喹诺酮类药剂主要为普通粉剂，仍存在溶解度较低的缺点。本文中SAR/β-CD包合物微囊的成功制备对喹诺酮类药物的推广应用具有重要的指导意义。