基于正交试验的切花乒乓菊组织培养体系的建立

郝春磊， 张 黎

（宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021）

乒乓菊是菊科、菊属草本花卉，有黄、绿、白、红等多种颜色，常作为鲜切花使用。乒乓菊造型独特，使用范围广泛，保鲜时间较长，花期可达20 d 以上，深受大众喜爱[1]。随着切花乒乓菊种苗需求量的快速增长，一些品种因反复扦插繁殖导致品种退化，而组织培养是解决此问题的重要手段。但瓶内生根存在污染不易控制、成本高、周期长、移栽成活率低等问题，而瓶外生根是瓶内快速繁殖与瓶外扦插技术相结合的繁殖方法，既可降低生产成本，又能缩短育苗周期，提高生产效率。

本试验开展切花乒乓菊组织培养技术与瓶外生根研究，探讨影响切花乒乓菊茎尖组织离体培养的因素及不同植物生长调节剂对切花乒乓菊脱毒苗瓶外生根的影响，旨在优化切花乒乓菊茎尖脱毒及苗瓶外生根技术，以期降低组织培养成本，简化操作程序，为实现切花乒乓菊工厂化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料源自银川市阿瓦隆生产日光温室的6 种切花乒乓菊，见表1。

表1 不同品种乒乓菊切花生长性状

1.2 试验方法

1.2.1 外植体最佳灭菌时间筛选 试验材料为切花乒乓菊6 个品种采后 30 d 生长的长 8～10 cm 脚芽。选取嫩芽2 cm 左右，去掉外边叶片后，在自来水下冲洗 3～4 次，无菌水冲洗 1～2 次。用滤纸吸干后，在超净工作台上用 75%酒精处理30 s，用无菌水冲洗 2～3 次后，用 0.1%升汞溶液灭菌（4、6、8、10、12 min）,再用无菌水冲洗 5～6 次，置于消毒烧杯中备用。无菌操作下将茎尖接种于MS 培养基上，每个处理接种 15 瓶，每瓶1 个外植体，重复3 次。15 d 后记录外植体的成活率和成苗率。

1.2.2 切花乒乓菊继代增殖培养基筛选 采用3因素3 水平正交试验设计，试验设计见表2。每处理接种 10 瓶，每瓶接 3 个瓶苗，重复3 次，30 d 后统计各品种切花在不同培养基中芽的增殖倍数并记录生长情况。

1.3 切花乒乓菊组培苗瓶外生根

从脱毒苗上取8～10 cm 的顶梢为插穗，保留2～3节，插穗下端蘸取不同生长调节剂溶液（100 mg/L NAA、100 mg/L IBA、100 mg/L ABT），基质采用珍珠岩和草炭（体积比 3∶7），扦插深度 3～5 cm;温度控制在15～25 ℃，空气湿度80%～90%，使叶片不出现萎蔫[2]。每处理扦插 180 株，重复 3 次。35 d 后每个处理随机抽样，统计生根数以及最长根长[3]（表3）。

2 结果与分析

2.1 切花乒乓菊茎尖组织灭菌时间筛选

由图1 可知，6 个切花乒乓菊品种的成活率随着灭菌时间的增长呈现先上升后急剧下降的趋势，各品种的成苗率随着灭菌时间的增加而不同。A1、A3、A6 在灭菌8 min 时，成活率和成苗率最高，分别为 91%、94%，88%、90%，82%、91%。A2、A4、A5 在6 min 时，成活率和成苗率最高，分别为80%、82%，79%、81%，74%、79%。各品种最适灭菌时间的成活率大小依次为 A1、A3、A6、A2、A4、A5；成苗率大小依次为 A1、A6、A3、A2、A4、A5。A1、A3、A6 灭菌时间为 8 min 时效果最佳，A2、A4、A5 灭菌时间为 6 min时效果最佳。

表2 L9(33)正交试验设计

表3 切花乒乓菊脱毒一代苗生长性状

图1 切花乒乓菊各品种茎尖组织灭菌时间及效果

2.2 切花乒乓菊继代增殖培养基筛选

由表4 可知，不同处理各品种增殖倍数差异明显，且品种之间也存在显著性差异。A1 的处理4 与其他处理存在显著差异，增殖倍数最高，为9.20，处理9 增殖倍数最小，为4.67，即A1 的继代增殖最优培养基为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L+蔗糖30 g/L。A2 的处理6 与其他处理之间存在显著差异，增殖倍数达到 10.60，而处理1 的增殖倍数最小，为4.80，A2 继代增殖最优培养基为 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.45 mg/L+蔗糖 25 g/L。A3、A4 的处理 4 和处理5 增殖倍数与其他处理之间存在显著差异，效果最佳的均为处理4，即 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L+蔗糖 30 g/L。A5 的各处理之间差异显著，其中效果最优的为处理 8，增殖倍数为 8.80，即6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖 25 g/L 为最佳。A6 的处理6 与其他处理差异显著，即6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.45 mg/L+蔗糖 25 g/L，增殖倍数最优达到8.40。

表4 切花乒乓菊各品种继代增殖正交分析结果

由表 5 可知， 各继代苗中，A1、A2 随着继代次数的增加，增殖倍数在2 代苗时达到最大，为9.40、9.80；A3、A5、A6 在 3 代苗时增殖倍数达到最大，为9.2、8.4、8.8；A4 随着继代次数的增加， 增殖倍数持续增长，在4 代苗时达到8.60。

2.3 不同生长调节剂对切花乒乓菊脱毒苗瓶外生根的影响

由表 6 可知，100 mg/L NAA、100 mg/L IBA、100 mg/L ABT 均对切花乒乓菊脱毒苗瓶外生根有一定的促进作用。3 种生长调节剂对A1 的生根数和根长影响不显著，100 mg/L ABT 时，达到最大值，生根数和最长根长分别为20.20、47.16 mm。3 种生长调节剂对A2 的生根数和最长根长影响显著，生根数分别为 11.60、14.20、19.20，最长根长分别为 34.62、29.68、35.67 mm。各调节剂对A3 的生根数和根长影响极显著，使用100 mg/L IBA 时达到最大值，生根数和根长分别为24.60、53.16 mm。3 种调节剂对A4的生根数和根长影响显著，生根数分别为12.00、13.40、12.20，根长分别为 44.33、47.40、43.19 mm。3种调节剂对A5 的生根数和根长影响不显著，生根数分别为 13.40、11.20、11.60，根长分别为 34.62、31.30、29.68 mm。3 种调节剂对A6 的生根数和根长影响显著，100 mg/L NAA 时达到最大值，生根数和最长根长分别为12.80、37.82 mm。综合生根数以及最长根长，A3、A4 最佳脱毒苗瓶外生根生长调节剂为 100 mg/L IBA，A1、A2 为 100 mg/L ABT，A4、A5为100 mg/L NAA。

表5 切花乒乓菊各品种继代增殖正交分析结果

表6 不同生长调节剂对切花乒乓菊脱毒苗瓶外生根的影响

3 讨论与结论

3.1 讨论

通过切花乒乓菊6 个品种茎尖组织脱毒与瓶外生根试验可知，6 个品种脱毒苗在各自最适培养基中均可正常生长，且各具特点。A1、A3、A4 的株高、节间距大于其他品种，仅A2 具有分枝，A5、A6 的生长周期（株高10 cm 时）最长，分别为44 d和41 d，其他品种均在30 d 左右。6 个品种脱毒苗瓶外生根率均为100%。杨文雅[4]以9 个品种切花多头菊的茎尖为外植体，研究不同激素浓度对其继代增殖的影响，研究结果显示继代增殖最佳激素配比为 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。陈黎等[5]以黄山贡菊的茎尖、叶片及根为外植体，进行了芽的诱导、继代增殖及瓶外生根壮苗试验，结果表明 MS+6-BA 2 mg/L+NAA 0.01 mg/L 是黄山贡菊芽继代增殖的最佳培养基。高琳娜[6]对黄金菊进行了组织培养试验，结果表明最有利于黄金菊腋芽增殖的适宜培养基是MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L。将本试验结果与前人研究对比可知，适用于菊花组培的生长激素为6-BA 和NAA，但不同品种的最适激素配比差异较大。生长调节剂可以促进植物插穗根原基的形成，从而促进根尖分化，缩短植物生根周期，提高生根率[7]。本试验表明，不同生长调节剂对切花乒乓菊脱毒苗扦插生根率的影响存在差异，这与大多数研究结果一致，也印证了脱毒对于切花乒乓菊性状改良的效果，既可以降低生产成本，又可缩短育苗周期，提高生产效率，因此脱毒苗培育可作为切花乒乓菊的主要生产方式。根据试验结果，6 个切花乒乓菊品种间的差异较大，应根据实际需求选择相宜的品种应用于切花乒乓菊脱毒苗生产。

3.2 结论

1）灭菌时间：紫色、酒红色、深粉色品种灭菌时间为8 min 时效果最佳；绿色、白色、黄色品种灭菌时间为6 min 时效果最佳。

2）继代增殖优选培养基：紫色、酒红色、白色品种为 6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.15 mg/L+蔗糖 30 g/L；绿色、深粉色品种为6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.45 mg/L+蔗糖25 g/L；黄色品种为6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+蔗糖 25 g/L。

3）继代增殖：除白色品种持续增长外，其他品种均呈先增长后降低的趋势，紫色和绿色品种在第2代时增殖倍数最大，酒红、黄色和深粉品种在第3 代时增殖倍数最大。

4）100 mg/L NAA、100 mg/L IBA、100 mg/L ABT均有利于切花乒乓菊脱毒苗瓶外生根。紫色、绿色品种瓶外生根生长调节剂为100 mg/L ABT；酒红色、黄色、深粉色品种为 100 mg/L NAA；白色生长调节剂为100 mg/L IBA。