青海湖裸鲤eif5b基因克隆与初步功能分析

周其椿， 张显波*， 李建光， 曾 圣， 闵倩雯， 陈飞雄， 杨 兴

(1.贵州省农业科学院 水产研究所， 贵州 贵阳 550025； 2.贵州省特种水产工程技术中心， 贵州 贵阳 550025)

0 引言

【研究意义】青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)属鲤形目，鲤科，裂腹鱼亚科，裸鲤属。俗称有湟鱼、花鱼、狗鱼、无鳞鱼。青海湖裸鲤为喜冷鱼类，分布于青海湖及其支流中，克鲁克湖、扎陵湖、鄂陵湖，其肉质鲜嫩，口味极佳，是青海湖中唯一的经济鱼类。近年来，由于自然和人为因素的影响，青海湖裸鲤资源急剧下降，甚至面临衰竭的危险。因此，对青海湖裸鲤展开生殖生理学研究，对解析其性腺发育机制具有重要意义，为其人工扩繁和分子遗传育种研究奠定理论基础。【前人研究进展】鱼类性腺发育受多个信号通路的共同调控，其中真核生物的翻译起始因子对性腺发育必不可少。真核生物翻译起始因子Eif5b(eukaryotic initiation factor 5b)是从原核生物、古细菌到真核生物都保守的翻译起始因子之一，在翻译起始过程的最后一步发挥作用。Eif5b是依赖核糖体的GTPase，与Met-tRNAi互作，共同促进20Spre-rRNA的剪切，并且在翻译起始的最后一步招募60S小亚基到40S大亚基，最终形成80S核糖体[1]。eif5b基因最早在酵母中发现，酵母的突变体fun12影响多聚核糖体的形成，进而导致生长缓慢，而外源重组的eif5b基因能够互补该表型。随后eif5b基因在人类[2]、果蝇[3]中被克隆。人类eif5b基因的GTP结合结构域发生突变会抑制翻译过程[2]，而果蝇中纯合的eif5b突变体的幼虫是致死的[3]。植物中报道的豌豆peif5b基因被认为是分子伴侣[4-5]，其编码的蛋白缺失eif5b基因的N端，仅包含C端部分序列，具有较高的热稳定性，能够阻止其他蛋白的的聚集[6]。【研究切入点】贵州省冷水资源量巨大，水质良好，水温常年稳定在11～25℃，适宜养殖高品质冷水性鱼类。与北方冬季严寒期长、南方夏季水温偏高相比，贵州省养殖冷水鱼普遍没有“半年养半年闲”的现象，十分适宜青海湖裸鲤产业的发展。目前，贵州省农业科学院水产研究所从青海引进养殖的青海湖裸鲤已能够完全适应贵州养殖环境。然而，eif5b基因在鱼类中的功能和作用未见报道。【拟解决的关键问题】围绕青海湖裸鲤卵巢中的eif5b基因克隆和功能，研究eif5b基因在青海湖裸鲤脑、垂体、鳃、心脏、肝脏、肠、脾脏、头肾、性腺、肌肉和肾脏组织中的分布情况及在卵巢各时期的表达情况。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用青海湖裸鲤从青海湖裸鲤救护中心引进，在贵州省农业科学院水产研究所试验基地培育。试验鱼于自然光周期下在22℃的恒温循环水系统中饲养，投喂汉业饲料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鲤eif5b基因克隆

根据GenBank中报道的相关物种的eif5b的基因序列，在基因保守区域设计合成简并引物，用此简并引物进行eif5b基因部分片段扩增及测序，获取青海湖裸鲤eif5b基因中间部分序列，并通过3′-RACE和5′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)及与其他鱼类基因组序列比对获取eif5b基因全序列。

1.3 eif5b基因的系统进化分析

进化树包括人(NP_001960.2)、小鼠(NP_775539.1)、鸡(NP_001006488.1)、龟(XP_025038838.1)、非洲爪蟾(XP_018086068.1)、金线鲃(XP_016356031.1)、鲫鱼(XP_026134766.1)、鲤鱼(XP_018972725.1)、斑马鱼(NP_955885.1)、罗非鱼(XP_031609405.1)和研究克隆的青海湖裸鲤eif5b氨基酸序列。进化树以NJ法采用MEGA 6.0构建。斑马鱼Eif4g3b(XP_009304365.1)氨基酸序列作为外类群。进化树中数值表示随机进行1 000次试验的步展值。

1.4 脊椎动物eif5b基因的共线性分析

脊椎动物eif5b基因及其相邻基因图谱的构建在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)网址上进行分析研究。

1.5 青海湖裸鲤eif5b组织表达模式分析

解剖24月龄青海湖裸鲤，取其脑、垂体、鳃、心脏、肝脏、肠、脾脏、头肾、性腺、肌肉和肾脏放于液氮速冻。按照RNAiso Plus操作说明提取总RNA，DNase I处理，逆转录合成cDNA，用基因特异引物进行扩增，检验eif5b在各个组织中的分布情况。以青海湖裸鲤β-actin作为内参，以卵巢cDNA模板为阳性对照，以双蒸水模板为阴性对照。

1.6 青海湖裸鲤eif5b基因在各时期卵巢中的表达情况

取3、6、9、12、18、24月龄的青海湖裸鲤卵巢液氮速冻，提取总RNA，合成cDNA。采用Real-time PCR检测eif5b基因在各时期青海湖裸鲤卵巢中的表达情况。管家基因β-actin作为内参，目标基因mRNA的相对表达水平采用公式R= 2-△△Ct计算[7]。结果表示为Ct值的平均值±标准偏差(Mean±SD)，采用SPSS进行显著性分析，组间差异采用单因素方差(one-way ANOVA)分析Duncan’s post-hoc检验，显著性水平设置为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 青海湖裸鲤eif5b cDNA 和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析显示，青海湖裸鲤eif5b全长cDNA序列为2 209 bp，包括5′端501-bp的非编码区，1 293-bp的蛋白质编码区和5′端415-bp非编码区；开放阅读框编码430个氨基酸(图1)。

2.2 脊椎动物eif5b序列对比和系统聚类

通过氨基酸序列的比对，eif5b在脊椎动物间有高度相似性，含有eif-5_eif-2b superfamily和W2 superfamily结构域；克隆的青海湖裸鲤eif5b与人、小鼠、鸡、龟、非洲爪蟾、金线鲃、鲫鱼、鲤鱼、斑马鱼、罗非鱼Eif5b间的氨基酸序列相似性分别为76.2%、76.2%、76.7%、75.7%、76.0%、95.1%、93.7%、94.2%、85.8%、87.9%(图2)。系统进化树分析显示，四足类人、小鼠、鸡、龟、非洲爪蟾的Eif5b氨基酸序列聚为一支，鱼类金线鲃、鲫鱼、鲤鱼、斑马鱼、罗非鱼、青海湖裸鲤的Eif5b氨基酸序列聚为一支(图3)。

2.3 脊椎动物eif5b基因共线性

共线性分析显示，eif5b与其邻近基因lipt1、mitd1、mrlp30、lgy2、lygl、txndc9、revl、aff3在人、小鼠和鸡中的共线性高度保守，蜥蜴的lipt1、mitd1、mrlp30、lgy2不共线，腔棘鱼和斑点雀鳝的lgy2、lygl不共线；鱼类中，除斑马鱼外，eif5b与其邻近基因lipt1、bco1l、kalrnb高度保守；四足类和鱼类只有lipt1和eif5b的共线性保守(图4)。

2.4 青海湖裸鲤eif5b组织表达模式

通过RT-PCR技术分析青海湖裸鲤eif5b在成鱼各个组织中的表达情况，eif5b主要表达于脑、垂体、鳃、心脏、脾脏、卵巢、精巢和肾脏(图5)，呈泛表达模式。

图5 青海湖裸鲤eif5b组织表达模式

2.5 青海湖裸鲤eif5b在卵巢不同发育阶段的表达

Real-time PCR分析发现(图6)，eif5b在3、6、9、12、18、24月龄卵巢中都存在表达，在3月龄表达量最低，6和9月龄持续显著升高，后期持续高表达。

图6 青海湖裸鲤eif5b在卵巢不同发育阶段的表达水平

3 讨论

eif5b作为翻译起始因子，在生物的多种信号通路和器官发育中有重要作用。研究表明，eif5b在青海湖裸鲤的多个组织中有表达，说明该基因的功能是多元化的。研究首次在鱼类卵巢中对该基因的表达功能进行研究，eif5b在整个青海湖裸鲤卵巢发育过程中都存在高表达，说明eif5b在各时期卵巢发育过程中都扮演重要角色。前人在线虫中研究显示，性腺中Vasa基因通过招募eif5b来调控下游基因翻译[8]，Vasa是大多数生物生殖细胞特异表达基因，高表达于各级生殖细胞。3月龄雌性青海湖裸鲤卵巢开始进行减数分裂，一般人工养殖条件下24月龄能够达到性成熟。从卵巢减数分裂起始至卵巢发育成熟，eif5b都存在高表达，说明鱼类eif5b很可能也与Vasa基因相偶联，受其招募，作用于下游基因，但其具体功能和作用机制，还有待进一步研究。

4 结论

研究成功克隆的青海湖裸鲤eif5b基因含有eif-5_eif-2b superfamily和W2 superfamily结构域；系统进化树分析显示，以斑马鱼Eif4g3b作为外类群，克隆的eif5b与其它脊椎动物的eif5b聚为1支，且克隆的eif5b与其它脊椎动物的eif5b序列同源性最低为75.7%，最高达95.1%；共线性分析显示，四足类及四足类祖先鱼类腔棘鱼和斑点雀鳝eif5b基因及相邻基因相当保守，蜥蜴中共线性不保守的几个基因可能由测序拼接不完整造成。鱼类的eif5b基因及相邻基因的共线性十分保守，斑马鱼的不保守型也可能是由于测序拼接不完整造成。