吲哚菁绿分子荧光影像技术在乳腺癌单孔法腔镜前哨淋巴结活检术中的应用

王子函，冈天然，武珊珊，高国璇，谢 芳，徐 飚，屈 翔，张忠涛

(1.首都医科大学附属北京友谊医院普通外科，北京，100050；2.首都医科大学附属北京中医院普通外科；3.广东省中医院乳腺科)

前哨淋巴结活检术(sentinel lymph node biopsy，SLNB)是目前临床上广泛应用于判断早期乳腺癌腋窝淋巴结转移状态的术式。传统前哨淋巴结示踪法包括染料法与核素法，两者均有其局限性，使用传统淋巴示踪剂，不论开放抑或腔镜进行SLNB，均存在假阴性的问题[1]。临床医师一直在寻找新的示踪剂、准确获取前哨淋巴结的方法，以进一步提高SLNB的检出率、降低假阴性率。吲哚菁绿(indocyanine green，ICG)因可在近红外光线下显示荧光，已广泛应用于胃癌[2]、子宫内膜癌[3]的淋巴结示踪中。近年ICG的应用领域不断扩展并获得了较好的临床效果[4]，已证实可安全、有效地应用于乳腺癌的SLNB中。为进一步探讨ICG荧光影像技术与单孔腔镜SLNB联合应用的价值，我们将其与纳米碳示踪法进行了比较，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2019年3月1日至2019年12月30日在首都医科大学附属北京友谊医院接受单孔法腔镜SLNB的20例乳腺癌患者，均以ICG联合纳米碳混悬注射液作为示踪剂。手术切除的前哨淋巴结(sentinel lymph node，SLN)送术中冰冻检查及常规石蜡病理检查。比较SLN检出率、SLN转移数量及ICG联合纳米碳显影技术总计检出SLN数量、ICG显影技术检出SLN总数(包括ICG单独显影、ICG与纳米碳均显影的SLN)、纳米碳黑染的SLN数量(包括纳米碳单独黑染、ICG与纳米碳均显影的SLN)。患者中位年龄59.5岁(31～70岁)；肿瘤位于左侧11例，右侧9例；浸润性导管癌17例，浸润性小叶癌2例，原位癌1例；肿瘤分期T1期10例，T2期10例。本临床试验经我院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 入选与排除标准 入选标准：(1)经空芯针穿刺或切除活检诊断为乳腺癌；(2)触诊未及明显肿大的腋窝淋巴结；(3)无远处转移。排除标准：(1)曾接受腋窝区手术而破坏此区域的淋巴组织；(2)多病灶的乳腺癌；(3)临床发现有腋窝淋巴结转移；(4)曾接受乳腺区放疗或相关化疗。

1.2.2 仪器与试剂 注射用ICG 25 mg/支，纳米碳混悬注射液0.5 mL/支；腔镜近红外荧光探测仪。

1.2.3 手术方法 ICG使用前先用10 mL灭菌注射用水溶解，溶解后质量浓度为2.5 mg/mL。取2.5 mg/mL的ICG 0.2 mL，用灭菌注射用水稀释至1 mL(即0.5 mg/mL)作为使用的质量浓度[5]。分别于乳晕外缘、上缘皮内注射0.5 mg/mL ICG 1.0 mL，于乳晕内缘及下缘分别皮内注射纳米碳1.0 mL；注射位置见图1。患者取仰卧位，患侧肩部垫高，患侧上肢包裹无菌巾后外展90°。灭菌注射用水125 mL+生理盐水125 mL+2%利多卡因40 mL+0.1%肾上腺素0.5 mL配置成溶脂液，使用顶端圆钝的溶脂针注射入筛状筋膜与喙锁胸筋膜之间、SLN所在区域，注射总量约150 mL。15 min后，使用单向侧孔的吸脂器进行该区域的吸脂。于腋中线平乳头位置做2.5 cm小切口，置入单孔腔镜Trocar，充入CO2，压力维持在8 mmHg，气体流量为35 L/min，建立手术所需空间，置入腔镜器械及荧光腹腔镜，分离镜头前的纤维结缔组织。在荧光腹腔镜发出的近红外光的激发下，ICG发出可被荧光腹腔镜接收的近红外荧光，并通过计算机处理显示成像。术者可在显示屏上直接观察到被激发出绿色荧光和(或)黑染的SLN及与之相连的淋巴管。离断淋巴管及SLN周围纤维结缔组织，切除激发绿色荧光或被纳米碳黑染的淋巴结。经单孔装置取出SLN标本，并送快速冰冻病理检查。存在SLN转移的患者，继续行腔镜腋窝淋巴结清扫术；SLN无转移的患者，用生理盐水冲洗术野，放置硅胶引流管连接负压吸引器。术后第3天拔除引流管。需同时进行皮下腺体切除术或假体置入乳房重建术的患者，经同一单孔切口完成后续操作。

图1 ICG(黑色箭头)及纳米碳(红色箭头)注射位置

1.3 统计学处理 应用SPSS 22.0软件进行数据分析。ICG、纳米碳及联合染色三种方式淋巴结检出数量的比较分别采用配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ICG荧光示踪结果 参与研究的患者均无不良反应出现。20例患者均在置入荧光腹腔镜后快速而清晰地看到荧光淋巴管显影及与之相连的荧光SLN(图2、图3，两种模式下均可见到清晰的荧光SLN)。取出SLN后，对淋巴结逐一分离，记录SLN染色情况(图4a为肉眼可见SLN，图4b为荧光腹腔镜探照下的SLN)。手术时间平均(17.50±2.60)min。

图2 术中见清晰荧光SLN(黑色箭头)及淋巴管(红色 图3 黑白荧光模式下所见SLN(蓝色箭头)及淋巴管 箭头) (白色箭头)

2.2 ICG及纳米碳在SLN中检出结果的比较 采用ICG联合纳米碳示踪法的20例患者均成功检出SLN，检出率100.0%。患者均有SLN荧光显影，ICG SLN检出率100.0%；1例患者纳米碳未着色，纳米碳SLN检出率95.0%。

ICG联合纳米碳法共检出SLN 97枚，平均(4.85±2.22)枚；ICG检出SLN总数89枚，平均(4.45±1.86)枚，ICG检出SLN所占比例为91.8%；纳米碳检出SLN总数77枚，平均(3.85±1.98)枚，检出SLN所占比例为79.4%。ICG示踪所获得的淋巴结检出数量显著多于纳米碳示踪(P=0.007)；ICG与纳米碳联合示踪多于单独ICG示踪(P=0.028)或单独纳米碳示踪(P<0.001)。

20例患者中ICG检出SLN转移3例，转移SLN共7枚；纳米碳仅检出其中2例共5枚转移SLN。

3 讨 论

乳腺癌是全球诸多国家成年女性中最常见的恶性肿瘤，其发病率、病死率随着我国居民生活方式的改变而呈逐年上升、年轻化的趋势。SLNB作为目前医疗技术中安全系数较高、检测结果较为精确的标准术式，被广泛应用于乳腺癌患者腋窝淋巴结状态的评估[6]。目前临床应用的示踪剂分为核素与染料两类。放射性核素标记大分子示踪剂的生产、存储及应用过程复杂，需要核医学科的配合，开展与实际应用受到多方面限制。亚甲蓝与纳米碳作为在国内广泛使用的示踪剂，依靠与周围组织的色差显示蓝染或黑染的SLN；当周围组织由于出血、电刀产生焦痂等原因与着色的淋巴结混淆时便容易遗漏SLN。美国临床肿瘤学会分析了69项研究，共观察8 059例患者，结果显示SLNB的假阴性率为8.4%[1]。如何提高SLN检出的成功率、降低假阴性率是近年研究热点之一。

ICG荧光显像技术通过荧光显影更直观而有视觉冲击力地显示出激发荧光的SLN[7-8]，已成熟应用于早期胃癌SLN的标记[9]及子宫内膜癌SLN的定位[10]。然而，ICG荧光显像技术在乳腺癌SLN示踪中的应用却不尽人意。Kitai等[11]利用ICG的自发荧光特性进行开放乳腺癌SLNB，成功率为94%(17/18)；Guo等[12]使用ICG联合美蓝示踪，对200例病灶行开放的SLNB，有多达16例病灶未能经皮肤见到荧光的SLN，成功率为92%。究其原因，主要因开放手术中注射ICG后，体表仅能探测到走行较浅的淋巴管所激发的荧光；而继续走行于筛状筋膜深处、距体表位置更深的SLN所发出的荧光，是无法被常规方式直接探测到的。这就使常规开放手术进行乳腺SLNB时，只能根据荧光显示的淋巴管末端，再向外侧约1 cm处盲目切开皮肤与皮下组织，在其中寻找SLN。这种开放手术时不能直接“看到”SLN本身，而只能通过淋巴管荧光“估测”SLN位置的手术过程，导致ICG在开放手术中未能发挥真正的作用[13]。

本中心将ICG荧光显像技术与单孔法腔镜乳腺癌SLNB相结合。置入皮下组织深处的腔镜，不仅可放大手术野及精细结构，更可直接看到发出强烈荧光的SLN；规避了开放手术中由于皮肤、皮下组织的阻隔，无法直接探测到SLN的难题。此外Jung等[14]、Boni等[15]认为，ICG分子荧光影像技术利用近红外光系统使术者可更加精准地辨别SLN，将其与周围其他组织区分。本研究也发现，荧光显影的SLN与周围组织之间的差异非常明显，甚至即使淋巴结表面包裹有较厚的脂肪组织时仍可透过脂肪组织，清晰地见到淋巴结激发的荧光，大大简化了SLN的寻找过程、降低了遗漏SLN的几率。

本研究中，置入荧光腹腔镜后不仅可见到激发出荧光的淋巴管，还能快速而清晰地见到荧光显影的SLN，从而直接完成SLNB，手术时间平均(17.50±2.60)min，我中心前期单独使用纳米碳示踪的腔镜SLNB手术时间平均(49.78±7.32)min；经对比发现，ICG示踪的手术时间明显缩短[16]。在SLN检出率方面，依靠ICG可检测到SLN的比率为100%。文献报道，国内染料法SLN检出率为89.84%，核素法检出率为92.26%，联合法检出率为94.93%[17]。我中心研究结果提示，ICG示踪法或许可进一步提高SLN检出率。与之相对的是，1例(5.0%)患者未能见到纳米碳着色，而是完全依靠ICG找到SLN；提示如果仅采用染料法示踪SLN，本例手术可能失败。

在SLN假阴性率方面，已有相关研究表明，SLN假阴性率可随SLN检出数量的增加而降低：仅切除1～2枚SLN可能增加遗漏阳性淋巴结的几率，切除3～4枚淋巴结能将假阴性率降至5%以下[18-19]。本研究中腔镜下ICG联合纳米碳示踪，每例患者检出的前哨淋巴结数量高于纳米碳示踪(P<0.001)。尤其值得注意的是，3例SLN存在转移的患者、共7枚转移SLN，均被ICG检出，而纳米碳仅检出其中2例患者共5枚阳性SLN，1例患者与两枚存在癌转移的SLN漏检，也就是说，如果单纯使用染料法，此例患者很可能成为SLN假阴性病例。

本研究将ICG荧光探测技术与单孔法腔镜SLNB联合应用，在直接而简单找到SLN的同时具有较高的SLN检出率、更多的淋巴结检出数量，并且可能带来较低的SLN假阴性率，具备一定的推广与应用前景。本研究病例数较少，且未设立对照组，计划开展前瞻性对照研究，进一步验证此方法的有效性与安全性。