基于荧光光谱技术研究增效肥料对土壤富里酸荧光特性的影响

胡 钰，魏 丹，*，李 艳，王 伟，白 杨，金 梁，蔡姗姗

1.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030 2.北京市农林科学院植物营养与资源研究所，北京 100097 3.黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，黑龙江 哈尔滨 150086 4.沈阳农业大学土地与环境学院，辽宁 沈阳 110866

引 言

土壤腐殖质占土壤有机质的60%～90%，土壤腐殖质是土壤有机物存在的一种特殊的形式，根据其在所有酸性和碱性溶液下溶解度的明显差异，可按其溶解度分为三个组分，在所有pH下均可溶的富里酸(FA)、在酸性条件下(通常pH<2)不溶的胡敏酸(HA)和在酸碱条件下均不溶的胡敏素(HU)。衡量土壤肥力的一个重要的指标就是土壤腐殖质，土壤腐殖质对土壤理化特性有着很大的影响，例如通过增加土壤团聚体和土壤通气能力达到保水的目的，增加土壤微生物可加快有机物的矿化并提高生物利用度，同时也能促进一些大量营养元素和微量营养元素用于植物吸收以及微生物生长，许多学者将其视为研究的热点[1]。FA是腐殖酸和土壤溶解性有机碳库的重要组成部分，土壤FA比土壤HA具有更高生物可利用性和理化活性，在土壤中有机物质的迁移、矿化进程中起到了重要的作用[2]。因此，有学者开始使用各种分析方法分析FA的结构特性、物质组成[3]。根据三维荧光光谱和平行因子分析法(PARAFAC)，可以将复杂的三维荧光光谱分解为单独的荧光成分，并减弱荧光化合物之间的干扰，因此已成为定性和定量描述溶解性有机质特定荧光信息的灵敏且可靠的分析方法，从而揭示荧光光谱所存在的无法识别的差异，是解析溶解性有机质和腐殖酸类物质结构、组成特性的重要资料和方法。以往研究报道对应用荧光光谱探明肥料对于土壤FA荧光特性和结构特征的影响的关注较少[4]。纳米碳作为肥料增效剂可促进植物发育、改善土壤性状，而将纳米碳作为肥料包膜材料与荧光特性之间关系的研究却较少，有研究表明[5-6]，发现它可以在一定程度上可提高土壤酶和土壤微生物的活性，间接提高土壤腐殖化程度。沸石作为肥料增效剂具备许多优势，但是应用荧光光谱探究沸石材料的荧光特性的研究却很少，在土壤中施入沸石，能够在一定程度上减少有效营养元素及养分的损失[7]，提高土壤腐殖化程度[8]。Beesley等[9]研究表明，向土壤中施入生物炭，可以增加土壤孔隙水中的溶解性有机碳；赵世翔[10]和Laird[11]等研究表明，生物炭施入量越大，土壤有机碳含量越高。

基于此，使用荧光光谱和平行因子分析的方法，对施入纳米碳包膜肥料、沸石包膜肥料以及生物炭包膜肥料的土壤FA组成及其结构进行分析评价，主要的目标是三个：(1)分析增效肥料对土壤FA结构特性和荧光特性的影响；(2)探究增效肥料对土壤FA荧光组分的影响；(3)初步阐明增效肥料对于土壤腐殖化程度的影响。这对于提升土壤腐殖化程度，拓展肥料和包膜材料的用途以及资源的可持续利用，具有重要的理论和实践意义。

1 实验部分

1.1 设置

试验于2018年5月在黑龙江省嫩江县、爱辉区进行。试验设置5个处理，各施肥处理、施肥内容以及施肥量详见表1，氮肥为尿素；磷肥为磷酸二铵；钾肥为硫酸钾。纳米增效肥料是以3‰的液体纳米碳对尿素和磷酸二铵在实验室下进行包膜处理；沸石增效肥料是以18%的沸石粉对尿素和磷酸二铵在实验室下进行包膜；炭基肥料是以18%的生物炭粉在实验室下对尿素和磷酸二铵进行包膜。指示作物为大豆(黑河43) ，采用大豆垄上双行栽培技术，于2018年9月采集表层0～20cm的土壤样品。

表1 施肥处理与对应肥料Table 1 Fertilization treatment and corresponding fertilizer

1.2 样品采集和实验方法

1.2.1 FA提取与纯化[1]

准确称取过0.25 mm筛土样5.00 g，加入30 mL去离子水，震荡(180 r·min-1，50 ℃)浸提24 h，离心(3 500 r·min-1)15 min得上清液，用去离子水定容至50 mL并取30 mL于三角瓶中，用6 mol·L-1HCL调节pH使pH 1.0，静置12 h后离心(3 500 r·min-1)15 min，得上清液过滤。将滤液定容至50 mL，过0.45 μm纤维树脂滤膜，即得含粗FA的滤液。将滤液通过树脂柱，即可以完成FA的纯化过程。

1.2.2 荧光光谱测定

待测FA样品经TOC分析仪(multi N/C 2100)测定其浓度，将所有FA样品稀释至一致浓度，采用三维荧光光谱仪(日立F-7000)测定荧光光谱参数。主要性能参数：激发波长(Ex)扫描范围：200～490 nm，带宽10 nm；发射波长(Em)扫描范围：250～550 nm，带宽5 nm。PARAFAC分析时，应消除水离子的散射，消除拉曼散射对荧光数据的影响。

1.3 数据分析

利用MATLAB 2010进行三维荧光图谱的绘制和PARAFAC分析；利用ORIGIN 9.1计算三维荧光区域积分、FI指数(Em在470和520 nm处荧光强度的比值)和BIX指数(Ex在310 nm处，Em在380与430 nm处荧光强度的比值)；利用SPSS 19.0进行相关分析。

2 结果与讨论

2.1 不同增效肥料的土壤富里酸三维荧光特性差异

根据Chen等[12]提出的三维荧光区域积分(FRI)方法，计算荧光三维图谱各区域荧光响应比值(percent fluorescence response，Pi，n) 。Tang等[13]对溶解性有机质( DOM) 的三维荧光图谱进行了荧光区域积分将其分为五个荧光区域，根据三维荧光区域积分(FRI)的方法，各个区域所对应的物质相对含量可由Pi，n值反映，将紫外荧光FA区域Ⅲ、可见荧光FA区域Ⅴ所对应的物质相对含量(Pi，n)记为PⅢ，n，PⅤ，n，PⅤ，n/PⅢ，n可以用来反映土壤的腐殖程度[14]，其中Pi，n越大，土壤的腐殖化程度也就越大。

由表2、表3可知，嫩江试验区的T1处理的PⅤ，n/PⅢ，n为2.69，比CK处理增加了4.26%，较NE处理增加了0.37%；爱辉试验区的T1处理的PⅤ，n/PⅢ，n为2.67，比CK处理增加了3.49%，较NE处理增加了1.52%，这是由于施入纳米碳增效肥料可以提高可见荧光富里酸区域的物质相对含量，从而达到提高土壤腐殖化程度的作用。嫩江试验区的T2处理的PⅤ，n/PⅢ，n为2.73，比CK处理增加了5.81%，较NE处理增加了1.87%；爱辉试验区的T2处理的PⅤ，n/PⅢ，n为2.70，比CK处理增加了4.65%，较NE处理增加了2.66%，这是由于沸石材料属于高表面活性矿物，沸石对土壤和水体中的营养元素有较好的吸附作用，并能调节土壤颗粒结构改善理化性质，是营养元素良好的滞留场所，所以沸石包膜肥料较普通无机肥料可以有效延缓腐殖物质随雨水流失，使FA等腐殖物质储存在土壤中。嫩江试验区的T3处理的PⅤ，n/PⅢ，n为2.69，比CK处理增加了4.26%，较NE处理增加了0.37%；爱辉试验区的T3处理的PⅤ，n/PⅢ，n为2.65，比CK处理增加了2.71%，较NE处理增加了0.76%，这是因为生物炭疏松多孔的结构使其具有很强的吸附和持水能力，所以施加生物炭增效肥料有利于提高土壤的持水能力和有机质的积累[11-12]。

表2 嫩江不同施肥处理下土壤FA的荧光参数Table 2 Fluorescence parameters of different fertilization treatments of fulvic acid in Nenjiang

表3 爱辉不同施肥处理下土壤FA的荧光参数Table 3 Fluorescence parameters of different fertilization treatments of fulvic acid in Aihui

图1 不同处理FA的去散射图Fig.1 Descattering diagram of fulvic acid treated with different fertilizers

以上数据能够说明T1，T2以及T3增效处理均可提高土壤FA腐殖化程度。根据FA传统荧光图谱分析表明，与CK处理相比，施用几种增效肥料可增加土壤FA的腐殖化程度，对于提高土壤FA的腐殖化程度的作用表现为：T2增效处理>T1增效处理>T3增效处理。土壤FA主要是通过施加肥料所产生的，其荧光特性主要与FA中的结构特性有关，FA中的苯环的数量和官能团往往会对其荧光特性有影响，其中三种增效肥料均能够不同程度提高土壤腐殖化的程度。

有研究结果表明[15]，r(A,C)为紫外区与可见光区FA荧光强度的比值，r(A,C)越大，土壤FA的芳构化程度越低。嫩江NE处理、CK处理、T1处理、T2处理、T3处理的r(A,C)值分别是0.372，0.387，0.371，0.364，0.371；爱辉NE处理、CK处理、T1处理、T2处理、T3处理的r(A,C)值分别为0.380，0.389，0.374，0.371，0.378。由此可知，不同试验地点下不同施肥处理的土壤FA结构复杂程度均表现为T2处理结构较复杂，T1处理和T3处理次之，以上3种增效处理的土壤FA结构复杂程度均大于NE处理，CK处理结构最为简单。其中嫩江试验区T2增效处理的r(A,C)值较CK处理降低了1.89%;爱辉试验区T2增效处理的r(A,C)值较CK处理降低了4.63%。施用三种增效肥料均能提高土壤FA组内的复杂程度，从而延缓土壤中富里酸的消耗，有利于土壤肥力的保持，因此施用增效肥料对于土壤肥力的保持作用是显而易见的。

2.2 不同新型肥料处理的平行因子分析

根据平行因子分析方法(PARAFAC)，将土壤FA分为C1、C2荧光组分，其中C1组分类富里酸；C2组分类胡敏酸。

平行因子分析方法识别出不同肥料处理的土壤FA均含有2个荧光组分。从图2可知，嫩江和爱辉试验区C1组分中均具有1个最大发射峰、2个最大激发峰，Ex/Em的波长均为230，320/410 nm。嫩江和爱辉试验区C2组分均具有1个最大发射峰、1个最大激发峰，Ex/Em的波长均为265/465 nm。由于C1组分的生物可利用性较高，因此可作为肥力供给的重要依据，其中C1组分的特征峰(Ex/Em：230/410 nm)，与A峰(Ex/Em<250/412 nm)十分接近，可用来表示腐殖质类物质[16]，特征峰(Ex/Em：320/410 nm)，位于传统C峰(Ex/Em：345/433 nm)、M峰(Ex/Em：325/385 nm)区域范围内，可能与构成FA分子的羰基和羧基有关。各处理C2组分为陆生来源FA组分，该组分对于改善土壤理化特性、促进团聚体形成具有显著的作用。从图2可知，嫩江、爱辉试验区C2组分均具有1个最大激发峰和1个最大发射峰，嫩江、爱辉试验区的C2组分Ex/Em均为265/465 nm，在传统A峰上方区域，能够表示氨基酸类腐殖物质。

图2 不同施肥处理的荧光组分光谱图Fig.2 Fluorescence component spectra of different fertilization treatments

2.3 不同肥料处理Fmax值差异分析

不同肥料处理Fmax相对含量的变化如图3、图4所示，各肥料处理间的平行因子分析方法识别出各组分相对含量说明各试验区域土壤FA以C1组分为主，C2 组分为辅。

图3 嫩江不同施肥处理下富里酸各荧光组分对应Fmax值Fig.3 Fmax values of each fluorescent component of fulvic acid treated with different fertilizers in Nenjiang

图4 爱辉不同施肥处理下富里酸各荧光组分对应Fmax值Fig.4 Fmax values of each fluorescent component of fulvic acid treated with different fertilizers in Aihui

T1增效处理、T2增效处理、T3增效处理的C1、C2组分均照CK处理的C1和C2组分有所增加，嫩江与爱辉试验区FA的C1和C2组分Fmax值如图3、图4所示。C2组分相对含量越高，土壤腐殖化程度就越高。嫩江试验区NE，CK，T1，T2以及T3处理的C2组分所占比例分别为53.98%，46.36%，50.52%，51.20%和47.71%；爱辉试验区NE，CK，T1，T2以及T3处理的C2组分所占比例分别为53.91%，46.23%，50.44%，51.08%和47.58%，由此，嫩江试验区与爱辉试验区土壤腐殖化程度均表现为NE处理>T2处理>T1处理>T3处理>CK处理。其中T2增效处理在嫩江试验区的PⅤ，n/PⅢ，n较CK处理提高了5.81%，C2/C1较CK处理提高了22.09%；T2增效处理在爱辉试验区的PⅤ，n/PⅢ，n较CK处理提高了4.65%，C2/C1较CK处理提高了20.93%。其中T1增效处理采用的是纳米碳增效剂，T1增效处理误差偏大可能是由于所选用的液体纳米碳在实验室条件下对肥料包膜的过程中纳米碳包膜不均匀造成的。结合FA的平行因子分析结果可证实，与CK处理相比，施用增效肥料增加了FA中的生物利用组分和陆生源FA类物质，表明FA中腐殖化水平、芳香度较高的组分对于土壤生态环境的改善有着积极的作用。

2.4 荧光组分与参数的相关性分析

通过SPSS对C1和C2两个组分和相关参数进行相关性分析。FI代表荧光指数，当FI<1.4时，DOM异源特征明显；当FI在1.4～1.9之间时，表示DOM是生物和非生物的混合液；当FI>1.9时，表明DOM来自于微生物代谢活动。BIX代表DOM的自生源参数，反映了自生源有机物对土壤DOM的贡献。FI和BIX均是指示DOM来源的指标，FI和BIX越大，越有可能是自生源产生；反之，越可能是外源输入。其中，嫩江试验区的FI值为1.60，BIX值为0.71；爱辉试验区的FI值为1.57，BIX值为0.73。由表4可知，C1和C2组分与FI和BIX均为负相关关系，说明土壤FA的两种组分有着相同的来源，平行因子分析所得到的C1和C2组分，均与陆源有机物质有关。

表4 C1和C2组分的Fmax与FI和BIX的相关性Table 4 Correlation between Fmax value of C1， C2 component and FI， BIX

3 结 论

(1)根据三维荧光区域积分方法以及不同肥料处理区域Fmax相对含量的变化，五个施肥处理中，T2增效处理对于提高土壤腐殖化程度，提高土壤的供肥水平表现最为显著。根据五个处理的比较结果显示，Fmax值表明，T2增效处理有效增加FA中C2组分。

(2)不同处理条件下土壤FA包含两种荧光组分，C1组分为类富里酸，C2组分为类胡敏酸；根据差异性分析结果显示，平行因子分析所得到的C1和C2组分的Fmax值与FI和BIX呈现出负相关关系，说明土壤FA的来源均与陆源有机物质有关。

(3)与CK处理相比，T1，T2和T3三个增效处理均对提高土壤供肥能力具有积极作用，其中T2增效处理的提升作用最为明显，采用沸石作为肥料增效剂对于土壤FA的积极作用要优于纳米碳和生物炭。利用增效剂对肥料表面进行包膜可以延长肥料的肥效和降低肥料的淋溶损失，沸石材料作为包膜肥料膜材料的一种，来源广泛且成本低廉，沸石材料内部孔隙较多、孔隙较大，沸石材料相较于纳米碳和生物炭有更大的比表面积，使用沸石材料包膜肥料能够为微生物提供良好的居留场所，促进微生物活动，进一步提高土壤FA水平，通过沸石材料包膜肥料对于增加沸石材料的应用方向以及包膜肥料膜材料的选择具有一定的指导意义，并且能够增加土壤腐殖化的程度。