桑叶和桑椹中的生育酚种类及含量检测*

唐 露 罗太明 谌伦富 黄传书

(重庆市蚕业科学技术研究院，重庆 400700)

生育酚又被称作维生素E，是一类脂溶性强抗氧化剂的同类物质统称，其根据甲基数目和位置的不同分为α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚4种形式。生育酚是生物体内一种十分重要的微量营养成分，人体缺乏生育酚会引起生殖系统萎缩和损害[1]。已有的研究表明，生育酚参与功能信号转导、基因表达调控及抗低温胁迫等多种代谢途径，在提高动物和人体免疫力及应激能力、维持正常的生殖功能、清除细胞自由基、抑制不饱和脂肪酸酸败，以及在发挥对植物光合器官的保护功能等方面都有十分重要的作用[1-3]。然而，具有重要生物学功能的生育酚却只能在具有光合作用的植物中合成，人体和动物均不能在体内合成生育酚，只能通过食用植物性食品或提纯的维生素E胶囊获得[4]。近年来，天然维生素E每年的需求增长达10%，但中国的天然维生素E产品较少，市场几乎被美国、德国、日本等国家垄断。人工合成维生素E的生物活性与天然维生素E相差甚远[5]，因此很有必要挖掘更多高维生素E含量的天然维生素植物源。

桑树(MorusalbaL.)在中国有几千年栽植历史，有着丰富的种质资源，传统栽桑主要用于养蚕缫丝。应用现代药学与检测技术的研究发现，桑树的叶、果、枝、根中含有生物碱、黄酮、多糖、多酚、氨基酸及丰富的维生素等功能性活性物质，这些活性物质具有抗炎[6]、降血糖[7]、抗氧化[8]、降血脂[9]、降血压[10]、清除自由基[11]等多种功效。桑树在营养保健领域的开发利用价值已被逐渐重视，但目前对桑树功能活性物质的研究主要集中在1-脱氧野尻霉素(DNJ)、黄酮类物质、花青素、多酚及多糖等几大类，关于桑树中生育酚的种类及含量研究则鲜有报道。鉴于此，本研究拟对桑叶和桑椹中α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的含量进行系统测定和分析，以期为桑树来源天然维生素E的开发利用提供试验依据和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料

于2020年5月4日上午9时(晴天)，在重庆市蚕业科学技术研究院桑树资源圃分别随机选择“中桑5801”和“北桑1号”2个桑品种树龄35年且长势基本一致的桑树各5株，每株从同侧、中上段采摘完全成熟的桑叶和桑椹，并将各品种5株桑树采摘的桑叶、桑椹分别混合后用去离子水冲洗，吸水纸吸干水分后，随即放入装有干冰的泡沫箱，带回实验室先放入-20 ℃、-40 ℃分别冷藏适应1 h，随后保存至超低温冰箱备用。

1.2 主要试剂和仪器设备

甲醇(色谱级，上海安谱)，超纯水。α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品(Sigma)。

干式氮吹仪(无锡沃信仪器)，岛津LC-20AT液相色谱仪(日本岛津)，C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm，日本岛津)，TLG-16低温离心机(湖南湘仪)。

1.3 标准液配制

分别精密称取α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚标准品 1 mg，置于1 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制为质量浓度1 000 μg/mL的混标储备液。将溶液转移至棕色试剂瓶中，密封后在-20 ℃下避光保存6个月，作为对照。

1.4 标准曲线绘制

将配制的对照品储备液用甲醇配制成含α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚分别为100 μg/mL的混合对照品溶液，取此溶液1 mL，用甲醇分别稀释至2 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、60 μg/mL共6个质量浓度的标准品混合溶液，取各个浓度上述溶液进样10 μL测定。以HPLC测得色谱峰面积(Y)与标准品浓度(X)进行线性回归分析。

1.5 待测样品液制备

将供试的桑叶、桑椹材料经高通量植物组织研磨器磨碎后，精确称取0.2 g样本，加入1%BHT乙醇溶液1 mL，混匀后加入100 g/L氢氧化钾溶液1 mL，混匀于85 ℃恒温提取40 min。冷却后加入2 mL石油醚振荡萃取10 min，取出醚相层，用超纯水清洗3次后，氮吹至干，加入1 mL甲醇复溶，用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内待测。

1.6 测定方法

1.6.1 液相条件

用岛津LC-20AT高效液相色谱仪测定。C18色谱柱：250 mm×4.6 mm，5 μm。流动相：超纯水(流动相B)与甲醇(流动相A)的体积比为10∶90。

1.6.2 梯度洗脱程序

开启电脑、检测器和泵，安装色谱柱，然后打开软件，在方法组中设置进样量为10 μL，流速1 mL/min，柱温20 ℃，设置梯度洗脱程序(表1)，走样时间为35 min，检测波长294 nm，设置完毕保存方法组。用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。

表1 样品中4种生育酚含量检测的梯度洗脱条件

1.7 重复性试验

精密称取样品6份，每份0.2 g，按方法“1.5”制备待测样品溶液，分别进样10 μL，记录4种成分的峰面积。以峰面积为指标计算重复性。

1.8 稳定性试验

精密称取供试样品0.2 g，按方法“1.5”制备待测样品溶液，分别于0 h、4 h、8 h、12 h、24 h取样10 μL测定色谱峰面积。

1.9 加样回收率试验

精密称取已知含量的样品6份，每份0.2 g，分别加入对照品0.05 mg，用60%甲醇定容至刻度，按方法“1.4”平行制备，进样10 μL，计算加样回收率。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 标准曲线及线性关系

配制的4种生育酚对照标液测定结果如图1所示，4种生育酚标准品分别在20.84 min(α-生育酚)、24.20 min(β-生育酚)、25.15 min(γ-生育酚)、27.28 min(δ-生育酚)出现峰值。以峰面积为纵坐标(Y)，以生育酚质量浓度为横坐标(X)计算得到各成分的校正曲线，具体如表2所示。从4种生育酚标准曲线分析看出，标液生育酚中4种有效成分的R2均>0.999[12]，表明其线性关系良好。

图1 4种生育酚标准品的HPLC图谱

表2 4种生育酚的标准曲线方程

2.1.2 仪器的精密度

用所配制的生育酚标准液对本试验使用仪器的精密度进行测试。结果显示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的相对标准偏差(RSD)值分别为1.10%、1.12%、0.60%和0.89%，均<0.05[13]，表明本试验测定仪器精密度良好，在可接受范围内。

2.1.3 方法的重复性

重复性试验结果显示，α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚RSD值分别为3.22%、4.77%、4.57%和2.67%，均<0.05[13]，表明该检测方法重复性较好，在可接受范围内。

2.1.4 样品溶液的稳定性

分对0 h、4 h、8 h、12 h、24 h获取的样品溶液进行稳定性测试。结果显示α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚的RSD值分别为2.78%、4.38%、4.19%、3.44%，表明在0～24 h时间段内，供试样品溶液性质稳定。

2.1.5 加样回收率

供试样品的加样回收率测试结果表明，4种生育酚的平均回收率分别为94.77%、96.15%、97.37%、98.58%，其RSD值分别为1.82%、3.33%、2.98%、3.24%(表3)。

表3 4种生育酚的加样回收率测试结果 回收率/%

2.2 桑叶和桑椹样品中的4种生育酚含量

采用HPLC法对2个桑品种的桑叶和桑椹样品中的生育酚成分及含量进行检测的结果如表4、图1所示，桑叶和桑椹中均含有4种生育酚。桑叶中含α-生育酚最多，中桑5801和北桑1号的占比分别为47.65%、62.49%；其次为δ-生育酚，2个品种的占比分别为33.3%、20.91%。桑椹中含γ-生育酚最多，2个品种的占比分别为44.67%、66.65%，其次为δ-生育酚，2个品种的占比分别为40.11%、28.73%，而生物活性最高的α-生育酚在桑椹中含量极低，2个品种的占比仅分别为5.13%和3.54%。总体而言，桑叶中总生育酚含量显著高于桑椹，2个品种桑叶中的总生育酚含量分别为桑椹的3.88倍、2.35倍，2个品种桑叶中的α-生育酚含量分别是桑椹的36.12倍、41.46倍。

表4 2个供试桑品种桑叶和桑椹中的4种生育酚检测结果 质量比/(μg·g-1，mf)

注：不同小写字母表示同一部位不同成分生育酚差异显著；**表示同一生育酚成分不同部位差异显著。

3 讨 论

本试验采用HPLC法对“中桑5801”“北桑1号”2个桑品种桑叶和桑椹中的α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚进行检测分析，结果表明：2个桑品种的桑叶和桑椹中均含有4种生育酚，桑叶和桑椹中4种生育酚含量差异显著(P<0.05)；桑叶中的总生育酚含量显著高于桑椹中的总生育酚含量，桑叶中的生育酚以α-生育酚为主，桑椹中的生育酚以γ-生育酚为主。

桑树作为一种药用植物资源，对其活性物质的深入研究具有重要意义。据已有的研究记载，生育酚在紫花苜蓿叶片中的平均质量比为31.81 μg/g[14]，而在莴苣叶中的质量比仅为0.2～0.8 μg/g[15]。本试验检测2个桑品种桑叶中的生育酚质量比均值为72.1 μg/g，显著高于上述2种植物，且桑叶中表现生育酚主要生物活性的α-生育酚含量最高，表明桑叶可作为天然维生素E提取及利用的植物原料。本试验为后续桑叶生育酚的提取纯化，生物活性鉴定以及高生育酚含量桑树品种的筛选奠定了良好基础。然而，本试验仅对2个桑品种的桑树成熟叶片和桑椹进行了取样测定，今后将对更多桑品种不同发育期的植株及不同器官部位中的各种生育酚含量进行检测，并探究其变化。