MiR-144-3p在肺腺癌中的机制研究

王江波

(濮阳市人民医院心胸外科，河南 濮阳 457009)

肺癌仍然是全世界癌症相关死亡的主要原因[1]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌的80%，其中大多数为肺腺癌(lung adenocarcinoma，LUAD)。尽管可以通过使用其他技术和新开发的治疗方法来提高LUAD的早期诊断[2]，但大多数患者的预后仍然很差。恶性肿瘤最常见的特征是转移，这是导致患者5年生存率低的主要原因[3]。因此，阐明LUAD的分子机制，探索治疗肺腺癌的新靶标具有重要意义。

微小RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，包括19～25个核苷酸。先前的研究结果表明[4]，成熟的miRNA可通过与3＇非翻译区(3＇-UTR)结合而抑制靶mRNA的翻译。miRNA在调节广泛的细胞过程中发挥关键作用，包括增殖、分化、凋亡和转移[5]。最近的研究已经发现，miRNA的异常表达与许多疾病密切相关，特别是癌症[6]。此外，在有关人类癌症的多项研究中，已经揭示了miR-144-3p作为肿瘤抑制因子的作用，例如，Liu等报道miR-144-3p通过靶向下调EZH2抑制LUAD细胞的增殖和侵袭[7]。miR-144还可以通过靶向ZFX抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移[8]。但是，关于miR-144-3p与钙黏着蛋白2(CDH2)在LUAD的作用机制还不清楚。

在本次研究中，我们系统阐述了LUAD中miR-144-3p和CDH2的作用机制，为LUAD的分子靶向治疗提供了新的思路。

1 材料与方法

1.1 生物信息学分析

从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载TCGA-LUAD的miRNA表达量数据和临床数据[n(Normal)=46，n(tumor)=521]，利用edge R进行差异分析(|logFC|>2，padj<0.01)。利用Target Scan数据库预测miR-144-3p的潜在靶向基因。同时，对TCGA中LUAD的基因表达情况进行差异分析(采用R语言“DESeq2”包，以正常样本为对照，进行差异分析，以|logFC|>1.5，adj p-value<0.05为差异mRNA筛选标准)，并选择分析结果中在LUAD中的差异上调基因与预测结果取交集。

1.2 细胞培养

人肺腺癌细胞Calu-3、HCC-827、NCI-H23以及人支气管上皮细胞HBE均购自美国ATCC公司。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基在37℃、5% CO2环境中孵育培养。

1.3 细胞转染

取对数生长期的HCC-827细胞2×105个悬于2mL完全培养液中，接种于6孔板内，细胞长至70%汇合时进行细胞转染。按照脂质体介导转染方法和LipofectamineTM3000说明书操作，将miR-144-3p-mimic、miR-144-3p-inhibitor及各自的阴性对照NC-mimic、NC-inhibitor转染至HCC-827细胞中。第二天，大概有70～80%细胞转染，使用定量qRT-PCR确定转染是否成功。

CDH2质粒购自GeneCopoeia(Germantown，MD，USA)，并使用Lipofectamine®2 000试剂盒转染到HCC-827细胞中，孵育48h后，使用定量qRT-PCR或Western blot分析确定转染是否成功。

1.4 qPCR检测

按上述分组分别收集2×105个细胞，使用TRIzol试剂(Invitrogen，CA，USA)提取总RNA，并使用生物分光光度计测定其浓度和纯度。使用PrimeScript RT试剂盒(TaKaRa，Dalian，China)将RNA反转录为cDNA。使用miRNA提取试剂盒(Tiangen，Beijing，China)进行miRNA提取。用SYBRPremix Ex Taq(TaKaRa，Dalian，China)进行qRT-PCR。U6和GAPDH内源性对照的相对表达水平通过2-ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR的引物序列

1.5 Western blot分析实验

使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(Beyotime Institute of Biotechnology，Haimen，China)提取总蛋白，并用BCA试剂盒(Beyotime Institute ofBiotechnology，Haimen，China)检测蛋白质浓度。将总蛋白(50μg)加入SDS-PAGE凝胶加样孔中，在60V条件下进行电泳，直至溴酚蓝从底部流出停止电泳。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素滤膜(NC)上，用脱脂牛奶(5%～10%)在室温下封闭2h。随后加入一抗，在4℃孵育过夜。第二天用1×TBST溶液(pH=7.4)洗涤3次，添加辣根过氧化酶标记的二抗山羊抗兔IgG(ab6721，1∶3000，abcam，Cambridge，UK)，杂交120 min后TBST洗膜3次，最后用ECL试剂盒(Solarbio，Beijing，China)进行发光反应，并进行拍照，实验重复3次。一抗包括：CDH2(ab76011，1∶10000，abcam)，GAPDH(ab9484，1∶2500，abcam)。

1.6 MTT测定

使用3-(4，5-dmethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)方法测定细胞活力。收集细胞并将其接种到96孔板中培养，在不同的时间段(24、48、72和96h)温育后，将20 μL溶于Hank平衡盐溶液的MTT四唑盐添加到每个孔中，终浓度为5μg/mL，并将板在CO2中温育培养箱中温育1～4h。最后，从每个孔中吸出培养基，并加入200μL二甲基亚砜以溶解甲瓒(Formazan)晶体。使用微量滴定板分光光度计以及参考波长为450nm获得每个孔的吸光度。每个实验重复3遍。

1.7 Transwell入侵检测

使用8 mm膜孔transwell室进行入侵测定。将无血清培养基中的1×105个细胞接种到上室中，该室预先用Matrigel(BD，Bedford，MA，USA)包被。温育24h后，将迁移至膜下表面的细胞用100%甲醇固定，并用0.1%结晶紫染色。然后用棉签除去上膜表面上的非侵袭性细胞。分别对下表面的细胞计数并拍照。

1.8 双荧光素酶实验

使用PCR扩增CDH2的3′UTR，并将其克隆到pmirGLO荧光素酶基因下游的多克隆位点中，并根据生物信息学预测的miR-144-3p与CDH2的靶结合位点进行定点突变，使用Lipofectamine 2000转染24孔板中70%融合的HCC-827细胞。每孔共转染构建的野生型或突变型pmirGLO载体(100 ng)、5 ng的pRL-SV40 Renilla荧光素酶构建体(用于标准化)和100 ngmiR-144-3p模拟物，miR-144-3p抑制剂或它们各自的NC。转染后48h制备细胞提取物，并使用双重荧光素酶报告基因检测系统(Promega，USA)测量荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

使用GraphPad Prism7.0软件进行统计学分析。所有值均表示为每组至少三个重复的单独实验的平均值±标准偏差，两组之间的比较采用t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MiR-144-3p在肺腺癌细胞中下调

首先，在TCGA-LUAD数据集中我们发现miR-144-3p在肿瘤组织中极显著低表达(图1A，封二)，且miR-144-3p低表达与肺腺癌患者预后不良显著相关(图1B，封二)。接着，我们检测了miR-144-3p在肺腺癌细胞及相应的正常细胞中的表达。qRT-PCR结果显示，与正常细胞相比，在肺腺癌细胞中miR-144-3p的表达均明显减少，其中以HCC-827的下调最为显著(图1C，封二)，因此，本文的后续实验选择了HCC-827细胞系作为研究对象。

2.2 MiR-144-3p负调控肺腺癌细胞生长、增殖和侵袭

我们使用qRT-PCR检测miR-144-3p在不同组HCC-827细胞中的表达情况，如图2A(封二)所示，miR-144-3p抑制剂可以明显抑制miR-144-3p的表达。MTT结果表明，miR-144-3p过表达的细胞系与其他三组相比，增殖能力显著下降，相反，抑制miR-144-3p表达，细胞增殖能力明显增强(图2B，封二，P<0.05)。此外，为了探究miR-144-3p在肺腺癌细胞侵袭中的作用，我们进行了Transwell侵袭实验。我们的研究结果(图2C，封二)表明，miR-144-3p过表达可以抑制细胞侵袭，反之亦然。以上结果表明，miR-144-3p负调控肺腺癌细胞生长、增殖和侵袭。

2.3 CDH2是miR-144-3p的直接靶标

我们利用生物信息学分析预测了miR-144-3p的直接靶标，结果显示CDH2的3＇-UTR与miR-144-3p结合，他们的结合序列如图3A(封三)所示。根据预测结果，我们进行了双重荧光素酶报告基因检测，以研究CDH2是否是miR-144-3p的直接靶标。在miR-144-3p和CDH2-3＇-UTR共转染的HCC-827细胞中，荧光素酶活性明显降低(P<0.05)。但是，在miR-144-3p和CDH2突变的3＇-UTR共转染的HCC-827细胞中，荧光素酶活性与对照组相比无明显差异(图3B，封三)。由此，我们可以确认miR-144-3p是CDH2的直接靶标。为了进一步证实这些结果，我们分析了CDH2在LUAD组织和细胞中的表达。利用TCGA-LUAD数据集我们发现CDH2在肿瘤组织中显著高表达(图3C，封三)。基于此，我们利用qRT-PCR和western blot检测了CDH2分别在人肺腺癌细胞Calu-3、HCC-827、NCI-H23以及人支气管上皮细胞HBE中的表达情况。与正常细胞相比，CDH2在肺腺癌细胞中均显著高表达(图3D、E，封三)。为了进一步研究miR-144-3p和CDH2在肺腺癌细胞之间的关系，我们检测了CDH2在不同处理下HCC-827细胞中的表达水平。结果显示，抑制miR-144-3p表达导致CDH2的表达上调，而过表达miR-144-3p则导致CDH2的表达显著下调(图3F，封三)。由此我们可以得出，CDH2是miR-144-3p的直接靶标，且在LUAD细胞中miR-144-3p能够靶向下调CDH2。

2.4 MiR-144-3p通过靶向下调CDH2抑制肺腺癌细胞的生长、增殖和侵袭

为了研究miR-144-3p和CDH2在肺腺癌中的作用机制，我们进行了一系列实验。首先，我们用miR-mimics以及miR-mimics+oe-CDH2分别转染HCC-827细胞，同时，NC-mimic以及NC-mimic+oe-NC转染的细胞用作对照组。qRT-PCR和Western blot如图4A(封三)所示，在肺腺癌细胞中，miR-144-3p过表达显著抑制CDH2的表达，而同时过表达miR-144-3p和CDH2则明显恢复，进一步说明了CDH2的表达能够被miR-144-3p下调。在上述转染的HCC-827细胞中分别进行MTT测定和Transwell侵袭实验。结果显示，过表达miR-144-3p后肺腺癌细胞生长、增殖和侵袭的能力明显下降(见图4B、C，封三)。由此可以说明miR-144-3p通过靶向下调CDH2抑制肺腺癌细胞的生长、增殖和侵袭。

3 讨 论

MiRNA是一类小的非编码的单链RNA分子，通常存在于植物、动物和一些病毒中，并且在RNA沉默和基因表达的转录后调控中发挥重要作用[4]。大多数miRNA在基因组中以单拷贝、多拷贝或簇的形式存在，并且大多数具有发夹结构。miRNA通过碱基互补配对(完全配对或不完全配对)靶向mRNA的3＇-UTR，直接降解mRNA或抑制翻译，从而完成对靶基因的转录后调控[9]。近几年来，越来越多的研究表明miRNA在细胞增殖、转移、分化等生物学过程中均发挥重要作用。研究发现miR-144-3p失调与多种人类癌症的进展有关，例如miR-144-3p通过下调ARID1A促进了透明细胞肾细胞癌中的细胞增殖和转移[10]。此外，miR-144-3p还通过抑制细胞繁殖、侵袭和迁移而在胶质母细胞瘤中起到抑癌作用。已经证实了miR-144在肺癌中明显下调[11]，这和我们的研究结果一致。Chen等报道，miR-144通过靶向下调TIGAR抑制肺癌细胞的增殖并诱导其凋亡和自噬[12]。但是，文献中尚未阐明miR-144-3p和CDH2之间的潜在联系。本次实验中，我们假设CDH2可能是肺腺癌细胞中miR-144-3p的直接靶基因，结果证实了这一假设。

CDH2编码一种称为N-cadherin的蛋白质，是cadherin家族的成员，调节许多生物过程[13]。研究显示[14]，CDH2通常在各种癌症中上调，例如，CDH2的过表达促进了耐厄洛替尼肺癌细胞的侵袭并诱导了EMT。研究发现，miR-124通过调节CDH2表达和EMT进程在NSCLC增殖和侵袭中起关键作用[15]。此外，有研究报道，miR-194通过靶向下调CDH2抑制骨肉瘤细胞的增殖和迁移[16]。本次研究中，我们发现CDH2在肺腺癌细胞中显著高表达，并且与miR-144-3p的表达呈负相关。

总而言之，我们的研究证实了miR-144-3p可以通过靶向下调CDH2抑制肺腺癌细胞的生长、增殖和侵袭，这对于探讨LUAD的作用机制提供了的新的参考，并且miR-144-3p可以作为LUAD的潜在分子治疗靶点。