斑点叉尾鮰鱼下脚料的多肽制备工艺

陈紫红，林志杰，薛雅茹，洪燕婷，王毅毅，黄茂坤

黎明职业大学材料与化学工程学院（泉州 362000）

斑点叉尾鮰鱼（Channel catfish），属于鲶形目、鮰科鱼类[1]。鮰鱼的肉质鲜美、细嫩，全身光滑无鳞，营养丰富，含有人体所必需的8种氨基酸、多种维生素以及大量的不饱和脂肪酸[2]。目前国内食品企业主要是进行斑点叉尾鮰鱼冷冻鱼片的初加工，但生产过程中产生的下脚料，如鱼头、鱼骨等占原料的40%～55%，除了少部分用于饲料鱼粉，大多数被随意丢弃掩埋，对环境造成了严重的污染，同时也形成资源的极大浪费[3-4]。

多肽是指分子质量在300～3 000 Da之间的一类化合物[5]，易被人体消化吸收。大量研究发现，多数多肽被发现有抗氧化、降血压、抗肿瘤等多种生理功能[6-8]。提取多肽的方法主要有化学提取法和酶法，二者相比酶法制备多肽反应温和快速、产物营养价值高而成为当今制备多肽的主流[9]。试验采用酶法制备斑点叉尾鮰鱼下脚料的多肽，以水解度为参考指标，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法探究斑点叉尾鮰鱼下脚料酶解的最优工艺条件，为斑点叉尾鮰鱼下脚料的高值化利用及相关产品的开发提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

新鲜斑点叉尾鮰鱼（市售）；酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶（均为生化级，北京索莱宝科技有限公司）；甲醛、盐酸、氢氧化钠等（均为分析纯，西陇化工股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

AL104IC型电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HHS型电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；K98II型电子调温万用电炉（天津市泰斯特仪器有限公司）；TG16-WS型台式高速离心机（湖南湘仪实验仪器制造有限公司）；SHB-Ⅲ磁力搅拌水浴锅（金坛市良友仪器有限公司）；PE20型pH计：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；78HW1型恒温磁力搅拌器（金坛市忆通电子有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 鮰鱼下脚料的蛋白质含量的测定

参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》。

1.3.2 鮰鱼下脚料的酶解工艺

鮰鱼下脚料→冷冻干燥→磨粉→称量→按照一定料液比配成溶液→调节酶解pH和温度→酶解→灭酶→离心取上清液→水解度测定

1.3.3 水解度（Degree of hydrolysis，DH）的测定

采用甲醛电位滴定法[10]对双孢蘑菇酶解液的水解度进行测定，按式（1）～（3）计算。

式中：ΔV为滴定样品与滴定蛋白原液所消耗的标准NaOH溶液体积之差；C为NaOH标准溶液浓度，mol/L；W为原料质量，g；V总为酶解液的总体积，mL；V为滴定取用的酶解液体积，mL；n0为水解前每克蛋白游离的氨基毫摩尔数，mmol/g；n为水解后每克蛋白游离的氨基毫摩尔数，mmol/g；htot为原料蛋白质中所含肽键总数，mmol/g；Pro表示样品的蛋白质含量，%。

1.3.4 单因素的测定

1.3.4.1 最适蛋白酶的筛选

将鮰鱼下脚料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，分别用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶和复合蛋白酶酶解原料。酶添加量1%，酶解pH、温度在各酶的最适条件下，反应时间1 h，反应结束沸水浴灭酶10 min，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液测定水解度。

1.3.4.2 酶添加量对鮰鱼下脚料水解度的影响

将鮰鱼下脚料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量分别为1%，2%，3%，4%和5%，酶解pH为6.0，置于50 ℃恒温水浴摇床中酶解1 h，反应结束沸水浴灭酶10 min，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液测定水解度。

1.3.4.3 酶解pH对鮰鱼下脚料水解度的影响

将鮰鱼下脚料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量3%，酶解pH分别为4，5，6，7和8，置于50 ℃恒温水浴摇床中酶解1 h，反应结束沸水浴灭酶10 min，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液测定水解度。

1.3.4.4 酶解温度对鮰鱼下脚料水解度的影响

将鮰鱼下脚料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量3%，酶解pH 5.0，分别置于40，50，60，70和80 ℃恒温水浴摇床中酶解1 h，反应结束沸水浴灭酶10 min，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液测定水解度。

1.3.4.5 酶解时间对鮰鱼下脚料水解度的影响

将鮰鱼下脚料配成料液比1∶30（g/mL）的溶液，酶添加量3%，酶解pH 5，置于70 ℃恒温水浴摇床中分别酶解1，2，3，4，5和6 h，反应结束沸水浴灭酶10 min，在8 000 r/min下离心10 min，取上清液测定水解度。

1.3.5 响应面设计

在单因素试验的基础上，选取影响显著的因素，采用Design-Expert 8.0软件设计响应面优化试验，建立各因素及其交互作用与水解度之间的数学模型，探讨酶添加量（A）、pH（B）、温度（C）三个因素及其交互作用对水解度的影响，确定最优的酶解工艺参数，其因素与水平编码见表1。

表1 中心组合试验因素水平编码表

1.4 数据统计方法

试验数据经3次重复试验获得，通过Office Excel对数据进行分析，使用Origin 7.5软件绘图及Design-Expert 8.0进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 最适蛋白酶的筛选

由图1可知，不同酶的水解效果差异很大，木瓜蛋白酶酶解鮰鱼下脚料得到的多肽远多于酸性蛋白酶和胰蛋白酶。在初始条件下，木瓜蛋白酶的水解度为31.77%，是酸性蛋白酶的4倍，因此选用木瓜蛋白酶作为后续的酶解。

图1 酶的种类对鮰鱼下脚料水解度的影响

2.1.2 酶添加量对水解度的影响

由图2可知，当酶添加量为1%～3%时，反应底物在酶的作用下其大分子蛋白被快速降解，使鮰鱼下脚料的多肽增加；当酶添加量超过3%时，水解度出现了一定的降低，可能是当酶浓度过高时，酶分子间可能相互水解，导致酶解效果下降[11]。因此，从经济的角度考虑，木瓜蛋白酶的最佳用量为3%。

图2 酶添加量对鮰鱼下脚料水解度的影响

2.1.3 酶解pH对水解度的影响

由图3可知，随着pH的增加，水解曲线呈先上升后缓慢下降的趋势，当pH为5时，水解度最高，pH为6时次之，这与木瓜蛋白酶的最适pH接近，说明木瓜蛋白酶在弱酸性环境下有较好的适应性。pH能够影响底物及酶的解离状态、空间结构，从而影响酶与底物的结合以及酶的活性[12]，因此确定最适pH为5。

图3 pH对鮰鱼下脚料水解度的影响

2.1.4 酶解温度对水解度的影响

由图4可知，随着温度的提升，水解度呈现缓慢上升后急剧下降的趋势。酶解温度在40～70 ℃范围内，溶液中多肽含量随酶解温度的升高而逐渐增多，此时分子运动加剧，酶活性增加导致水解度提升。当温度超过70 ℃时，蛋白酶空间结构被破坏，导致酶活力的急剧丧失。因此选定70 ℃为后续的酶解温度。

图4 温度对鮰鱼下脚料水解度的影响

2.1.5 酶解时间对水解度的影响

由图5可知，随着时间的增加，水解曲线呈先上升后缓慢下降的趋势。这可能是由于酶解时间过长，多肽被水解成氨基酸[13]。考虑到成本的问题，因此选择4 h作为酶解条件。

图5 时间对鮰鱼下脚料水解度的影响

2.2 响应面法优化酶解条件

根据表1的编码水平设计了17组试验，试验结果如表2所示。通过 Design Expert 8.0软件进行数据分析，建立多元二次响应面回归模型：DH=+40.1+1.52A+2.06B-3.1C-3.14AB-2.62AC-1.54BC-8.45A2-8.82B2-12C2。

由表3可知，模型的p＜0.01，表明该模型是极显著的，失拟项为0.184 4＞0.05，表明该模型能够很大程度上拟合真实的响应值变化，决定系数R2=0.975 1，表明鮰鱼下脚料酶解后的水解度变化有97.51%来源于所选变量。通过比对F值和p值的数据可以看出，各个因素的影响主次顺序为温度＞酶添加量＞pH。

各因素及交互作用对鮰鱼水解度的影响见图6。曲面越弯曲、等高线形状越接近椭圆，表示两因素之间的交互作用对于水解度的影响越大[14]。通过对比表3的AB、BC和AC的p值大小可知，AB即酶添加量和pH的交互作用对于鮰鱼水解度具有显著性影响，各个因素对于模型和响应值的影响并不是简单的线性关系。

表2 响应面组合试验设计结果

表3 中心组合试验设计方差分析表

图6 各因素及交互作用对鮰鱼水解度的影响

通过软件处理进行最优分析，可以得到鮰鱼下脚料酶解的最优工艺条件：酶添加量3.09%，pH 5.11，温度68.53 ℃。在该条件下，预测的响应值为40.51%± 0.87%。为适应试验条件，将验证酶解条件调整为酶添加量3%，pH 5.0，温度69 ℃。在该条件下，水解度为38.89%±0.21%，与理论值较为接近，可见该模型可信，能较好地预测酶解工艺。

3 结论

试验从减少资源浪费和环境污染的角度出发，以斑点叉尾鮰鱼的下脚料作为研究对象，探讨了不同酶的种类对于水解度的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面分析法优化木瓜蛋白酶酶解鮰鱼下脚料的制备工艺，得到最优酶解条件：酶添加量3%，pH 5，温度69 ℃。在此条件下，酶解液的水解度为38.89%±0.21%，为斑点叉尾鮰鱼的高值化利用及附加产品的开发提供了参考。