金枪鱼下脚料发酵法制备防腐功能海鲜调料

于学娟，李银塔 ，刘荣，彭昌盛，王韶华，东莎莎

1.烟台职业学院（烟台 264000）；2.威海海洋职业学院（荣成 264300）；3.中国海洋大学（青岛 266100）；4.荣成市综合技术转化中心（荣成 264300）；5.中华全国供销合作总社济南果品研究院（济南 250014）

金枪鱼是世界上主要的鱼类资源之一，具有较高经济价值，也是被国际营养协会推荐的绿色无污染健康美食[1-2]。金枪鱼富含丰富的优质蛋白质、维生素、脂肪等，尤其富含DHA和EPA，具有很高的营养价值，还可以改善记忆、促进大脑发育等[3]，因此被加工成各类食品。

对于金枪鱼的加工大部分集中在生鱼片和罐头类食品[4]，但是加工利用率较低，利用率只有30%～50%，伴随产生50%～70%的副产物[1]。金枪鱼副产物中富含大量的优质蛋白质、DHA和EPA等高营养价值成分，若丢弃则造成严重资源浪费，因此迫切需要将金枪鱼加工产生的副产物进一步开发利用。

对水产品副产物的开发，大部分研究都集中在采用酶法和发酵法，其中酶解的生产工艺操作简单，但是却无法消除水产品的腥味，并且加工产物容易变质、难于储存，市场接受度较低[3,5-13]；发酵工艺可生成抗菌作用的活性肽，可使加工产物去腥，还可延长保质期[14-21]，但是以发酵工艺加工金枪鱼副产物的研究却很少。试验使用金枪鱼下脚料，以水解度为指标，利用纳豆菌和枯草芽孢杆菌进行双菌液态发酵工艺研究，通过考察单因素试验和响应面（RSM）设计[10,17,22-24]对双菌（纳豆菌和枯草芽孢杆菌）发酵条件进行优化并进行相关分析，确定发酵的最佳工艺参数。利用最佳发酵工艺制备的发酵液生产防腐功能海鲜风味调料，并采用高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）联用仪分析其主要成分，为金枪鱼下脚料的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

金枪鱼（山东荣成市售）；枯草芽孢杆菌、纳豆菌（北京北纳创联生物技术研究院）；乙腈（美国Fisher Scientific公司）。

1.2 仪器与设备

TSQ Quantum Access HPLC/MS联用仪（美国Thermo公司）；UV-2450型紫外-可见分光光度计（日本岛津）；L-8900全自动氨基酸分析仪（AAA，日本HITACHI公司）。

1.3 试验内容

1.3.1 金枪鱼下脚料制备

取金枪鱼去除内脏和鱼皮的金枪鱼下脚料，清洗并绞碎备用。

1.3.2 菌株活化及生产菌液制备

取甘油封存的纳豆芽孢杆菌菌种，采用平板划线法接种到BPY培养基上，在37 ℃进行24 h倒置培养；将其接种于营养琼脂斜面，静置培养，24 h活化完成；将活化后的纳豆菌接种于液体培养基中，在温度37 ℃、摇床频率120 r/min培养24 h，培养液的OD630nm1.2～2.0即得到生产菌液。

取枯草芽孢杆菌冻干粉，将其溶于营养琼脂/肉汁培养基，采用涂布法接种到营养琼脂培养基，在37 ℃进行24 h倒置培养即得活化的枯草芽孢杆菌；将活化后的菌接种于液体培养基中，在温度37 ℃、摇床频率150 r/min培养24 h，培养液的OD630nm1.5～2.5即得到生产菌液。

1.3.3 双菌发酵工艺和响应面试验设计

1.3.3.1 双酶发酵制备防腐功能海鲜风味调料的工艺流程

将金枪鱼下脚料、麸皮和葡萄糖按15∶4∶1混匀作为发酵基质，装入锥形瓶中，加入一定量水，在121 ℃灭菌20 min，冷却至30 ℃；接入纳豆菌和枯草芽孢杆菌生产菌液（1∶1，V/V），置于40 ℃生化培养箱中发酵，期间每隔4 h搅拌1次，72 h后发酵完成；发酵终产物经过滤，获得防腐功能海鲜风味调料。

1.3.3.2 基质水分对双菌发酵的影响

分别调节基质水分80%，85%，90%，95%，100%和105%，在初始pH 7.5、接种量0.15 mL/g、发酵温度40 ℃条件下，进行双菌发酵72 h，研究基质水分对双菌发酵的影响。

1.3.3.3 接种量对双菌发酵的影响

分别调节接种量0.05，0.10，0.15，0.20和0.25 mL/g，在基质水分90%，初始pH 7.5，发酵温度40 ℃条件下，发酵72 h，探讨接种量对双菌发酵的影响。

1.3.3.4 pH对双菌发酵的影响

分别调节pH 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0和8.5，在基质水分90%，接种量0.15 mL/g，发酵温度40 ℃时，发酵72 h，研究pH对双菌发酵的影响。

1.3.3.5 发酵温度对双菌发酵的影响

分别设置发酵温度30，35，40，45和50 ℃，在基质水分90%，初始pH 7.5，接种量0.15 mL/g时，研究发酵温度对双菌发酵的影响。

1.3.3.6 发酵时间对双菌发酵的影响

分别设置发酵48，60，72，84和96 h，在基质水分90%，初始pH 7.5，接种量0.15 mL/g，温度40 ℃时，测定水解度，研究发酵时间对双菌发酵的影响。

1.3.4 发酵产物检测分析

1.3.4.1 肽类成分分析的色谱条件

对发酵后的产物采用张宁等[14]的方法分析抗菌脂肽成分，色谱柱采用氰柱Venusil XBP CN（100 mm× 2.1 mm，5 μm）；流动相A为乙腈；流动相B为含0.1%甲酸的乙酸铵溶液（5 mmol/L）；流速300 μL/min；梯度洗脱过程为A 40%和B 60%；质谱条件维持不变。

采用左爱华等[26]的方法分析蛋白肽成分，色谱柱采用C18（75 μm×15 cm，3 μm，100 Å）；流动相采用0.1%甲酸水（A）、乙腈（含0.1%甲酸，B）；梯度洗脱过程为10%～30% B，90～103 min；流速300 nL/min；质谱条件维持不变。

1.3.4.2 AAA检测条件[27]

分离柱采用4.6 mm×60 mm（阳离子交换树脂）；柱温57 ℃，进样量20 μL，缓冲液流速0.35 mL/min；茚三酮反应液采用流速0.35 mL/min、温度135 ℃；数据分析用自带软件。

1.3.4.3 水解度

在制备发酵基质前，准确称取金枪鱼下脚料质量，记为X；发酵后，用水漂除麸皮，使用低速离心机离心收集不溶物并称质量，记为Z。水解度计算如式（1）。

式中：Y为金枪鱼下脚料水解度，%；X为初始金枪鱼下脚料质量，g；Z为发酵后金枪鱼下脚料剩余质量，g。

2 结果与分析

2.1 双菌发酵金枪鱼下脚料工艺单因素试验结果与分析

2.1.1 基质水分对双菌发酵的影响

随着基质水分提高，金枪鱼下脚料的水解度呈现先增后降趋势，基质水分90%时，水解度达到最高为39.79%。这可能是因为水分是微生物生长和代谢的决定因素，在基质水分含量较低，双菌的生长受到抑制，导致次级代谢生成的酶量及其活性不足，而过高的基质水分会阻碍氧气的传递，抑制双菌呼吸生长，从而限制双菌的活性和降低酶生成量，因此选择基质水分90%。

图1 基质水分对双菌发酵金枪鱼下脚料的水解度影响

2.1.2 接种量对双菌发酵的影响

如图2所示，接种量小于0.15 mL/g时，双菌接种量增加，水解度随之增大，接种量0.15 mL/g时水解度42.32%，继续增大接种量，水解度基本不变，这可能是因为，随着接种量增加，菌类数量增大，产生竞争性抑制，因而影响水解度。因此，选用最适接种量为0.15 mL/g。

图2 接种量对双菌发酵金枪鱼下脚料的水解度影响

2.1.3 pH对双菌发酵的影响

如图所示，pH显著影响下脚料的水解度，pH小于7.5时，随着pH升高，水解度增大，而在pH 7.5时，达到最大，可达44.72%，增大pH，水解度降低。这可能是因为pH影响菌种的活性，过高或者过低的pH会抑制双菌活性，从而影响金枪鱼下脚料的水解度，因此最终选择pH为7.5。

图3 初始pH对双菌发酵金枪鱼下脚料的水解度影响

2.1.4 发酵温度对双菌发酵的影响

如图4所示，发酵温度对双菌发酵的影响较大，在一定范围内，金枪鱼下脚料的水解度随着发酵温度的升高而增大，温度40 ℃时，水解度达到最大，继续升高温度，水解度反而降低。这可能是因为在适宜的环境温度下，菌株生长与代谢旺盛，产生的次级代谢产物和酶数量多且活性高，反之，菌株的活性降低导致分泌的酶量不足，难以发挥蛋白质降解作用，故选择最佳发酵温度40 ℃。

图4 发酵温度对双菌发酵金枪鱼下脚料的水解度影响

2.1.5 发酵时间对双菌发酵的影响

由图5可知，发酵时间对金枪鱼下脚料的水解度影响显著，发酵时间小于72 h时，水解度随着发酵时间的延长而明显增大，发酵至72 h时，水解度达到44.72%，继续延长发酵时间，水解度基本不变。这是因为随着时间延长，基质中菌和酶的含量逐渐增加，基质不断被消耗，导致水解度先缓慢增加后急剧提高，而在发酵后期，产物与基质中底物产生竞争抑制或者产物占据酶催化部位导致酶失活，水解度达到平衡。因此选择最佳发酵时间为72 h。

2.2 防腐功能海鲜风味调料成分分析

2.2.1 氨基酸含量分析

由表1可知，双菌发酵产物中有18种氨基酸，总氨基酸含量达99.821 mg/mL，其中，积极呈味氨基酸由表现鲜味[28]的谷氨酸（Glu）和甘氨酸（Gly）、呈现甜味[28]的天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、丙氨酸（Ala）和脯氨酸（Pro）的7种氨基酸构成，其总的含量高达51.213 mg/mL，约占总氨基酸的51.3%，总的必需氨基酸量为37.623 mg/mL，约占总氨基酸的37.69%，表明此调味料具有营养和呈味双重功效。

图5 发酵时间对双菌发酵金枪鱼下脚料的水解度影响

表1 防腐功能海鲜风味调料中氨基酸组成和含量

2.2.2 蛋白肽成分分析

经RSM优化制备的金枪鱼下脚料蛋白肽用HPLCMS分析测定[29]，结果见表2，蛋白肽分子质量均小于5 000 Da，且分子质量主要集中在247～741 Da，约占总蛋白肽比例为77.239%。根据现有蛋白肽的国家标准[30-31]，试验产品为优质低聚肽，因而制备的调味料具有很高的应用价值。

2.2.3 脂肽成分分析

按照孙力军等[31-32]测定脂肽的方法，对试验双菌发酵的调味料进行脂肽分析，结果见表3。脂肽的分子质量主要集中在971.9～1 497.3 Da，根据分子质量的差值（相差14或14的倍数）情况可分为3组：1 497.3，1 483.3，1 470.1，1 469.3；1 048.6，1 034.8，1 020.8；1 057.8，1 043.4，1 028.8，1 014.4，1 000.2，986.3，971.9 Da。此类情况体现脂肪酸链相差nCH2或氨基酸链上Val和Ala（分子质量差28 Da）或Leu和Val（分子质量差14 Da）互相取代等脂肽结构的特征[31]。张宁等[14]研究报道的抗菌脂肽情况，双菌发酵的调味料中脂肽为Iturins、Fengycins和Surfactins 3种类型，3种脂肽具有良好的光谱抗菌作用，赋予调味料天然防腐功效。

表2 金枪鱼下脚料双菌发酵蛋白肽的分子质量分布

表3 金枪鱼下脚料双菌发酵脂肽的分子质量分布

3 结论

以金枪鱼下脚料为基础通过双菌发酵制备调味料，通过研究基质水分、双菌接种量、pH、发酵温度、发酵时间对调味料水解度的影响，优化制备工艺，通过条件优化所得最佳工艺参数为：基质水分90%，初始pH 7.5、接种量0.15 mL/g、发酵温度40 ℃，发酵时间72 h。利用HPLC-MS对金枪鱼下脚料双菌发酵产物进行成分分析，双菌发酵产物包括小分子肽（分子质量247～741 Da），约占总肽量的77.239%；18种氨基酸，其中积极呈味氨基酸占总氨基酸的51.3%；生成Iturins、Fengycins和Surfactins这3种抗菌脂肽，因而双菌发酵产物具有很高鲜味和营养且能够防腐，其可作为调味料应用。