微卫星不稳定状态与结直肠癌患者临床病理特征的相关性研究

张冬生 封益飞 王勇 胥子玮 唐俊伟 黄远健 张川 孙跃明

随着我国居民生活方式的改变、饮食结构的调整以及人口老龄化的进展，我国结直肠癌发病率、死亡率呈上升趋势。目前，结直肠癌发病率占我国所有恶性肿瘤的第3位，死亡率占第5位，分别为28.20/10万、13.61/10万［1］。探究结直肠癌的病理分子特征，对患者的个体化诊疗具有重要意义。染色体不稳定性（chromosomalinstability，CIN）（占80%～85%）和微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）（约占15%）是结直肠癌发生的两条主要分子途径［2］。MSI是由DNA错配修复（mismatchrepair，MMR）基因突变或启动子甲基化引起，错配修复功能的缺失，造成基因组中短串联重复序列的增加或减少，大量原癌基因或抑癌基因的突变不断累积，导致细胞调控失衡，最终造成肿瘤的发生。通常存在三种MSI状态：高度微卫星不稳定性（microsatellite instability-high，MSIH）、低度微卫星不稳定性（microsatellite instabilitylow，MSI-L）和微卫星稳定性（microsatellitestability，MSS）。MSI状态对应着较为特殊的临床病理特征，与结直肠癌患者的预后相关。本研究回顾性分析结直肠癌患者的临床病理资料，探究MSI状态与其临床病理特征的相关性。

资料与方法

一、一般资料

采用回顾性队列研究方法，收集2015年1月至2019年12月南京医科大学第一附属医院结直肠外科1 280例结直肠癌手术患者的临床病理资料，其中男性800例，女性480例；中位年龄为63岁，年龄范围为（26～91）岁。纳入标准：（1）病理检验确诊为结直肠原发性腺癌；（2）接受结直肠癌根治术；（3）限期手术患者。排除标准：既往肠癌病史、非R0切除、合并其他恶性肿瘤、多原发结直肠癌、结直肠肿瘤家族史、阑尾肿瘤、肛管肿瘤、术前辅助放化疗、炎症性肠病患者。本研究符合《赫尔辛基宣言》的要求。

二、观察指标

1.人口学特征：性别、年龄、BMI、术前血清CEA及CA19-9水平。

2.手术标本病理学检查：肿瘤部位、TNM分期、T分期、N分期、M分期、肿瘤分化、印戒细胞、黏液分化、病理形态、肿瘤最大直径、癌结节、脉管侵犯、神经侵犯、淋巴结检出数、阳性淋巴结检出数、淋巴结转移率（阳性淋巴结检出数/淋巴结检出数）（lymph node ratio，LNR）。依据AJCC第8版结直肠癌TNM分期系统进行肿瘤分期。

3.MSI状态。

三、PCR-毛细管电泳检测MSI状态

选取结直肠癌组织蜡块进行切片脱蜡提取DNA，采用MSI检测试剂盒扩增结直肠癌组织中BAT25、BAT26、D5S346、D2S123及D17S250等5个Bethesda标准位点的突变状态，当癌组织存在2个及2个以上突变位点时判定为MSI-H，当仅存在1个位点突变时判定为MSI-L，无位点存在突变则判定为MSS。

四、统计学分析

应用SPSS 24.0统计软件进行分析。计数资料以绝对数或百分比表示，组间比较采用卡方检验或Fisher精确检验。等级资料采用秩和检验。非正态分布的计量资料以中位数M（P25，P75）表示，组间比较采用曼-惠特尼U检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

1 280例患者中，右半结肠癌337例，左半结肠癌398例，直肠癌545例。TNM分期Ⅰ期215例，Ⅱ期649例，Ⅲ期359例，Ⅳ期57例。腹腔镜手术969例，达芬奇手术153例，开放手术158例。112例（8.7%）为MSI-H，79例（6.2%）为MSI-L，1 089例（85.1%）为MSS。

二、MSI状态与结直肠癌患者的临床和病理特征的关系

MSI-H组患者CEA＜4.7ng/mL所占比例显著高于MSS/MSI-L组患者（χ2=6.943，P＜0.05）（见表1）。MSI-H组与MSS/MSI-L组患者在肿瘤部位（Z=-9.451，＜0.001）、肿瘤TNM分期（Z=-2.108，P＜0.05）、肿瘤T分期（Z=-2.397，P＜0.05）、肿瘤N分期（Z=-3.892，＜0.001）、肿瘤分化（χ2=6.663，P＜0.05）、黏液成分 （χ2=78.833， ＜0.001）、肿瘤最大直径（χ2=39.656，＜0.001）、癌结节（χ2=8.759，P＜0.05）、神经侵犯（χ2=10.238，P＜0.05）、LNR（χ2=5.880，P＜0.05）、淋巴结检出数（Z=-5.019，＜0.001）、阳性淋巴结检出数（Z=-3.667，＜0.001）等方面差异有统计学意义（见表2），主要表现为，MSI-H组患者右半结肠癌、低TNM分期、高T分期、低N分期、低分化、黏液成分、肿瘤直径≥4cm、无癌结节、无神经侵犯、低LNR所占比例显著高于MSS/MSI-L组患者。MSI-H组患者淋巴结检出数显著多于MSS/MSI-L组，而阳性淋巴结检出数显著较少。

表1 MSI状态与结直肠癌患者的临床特征的关系［例（%）］

表2 MSI状态与结直肠癌患者的病理特征的关系［例（%）］

续表

讨 论

MSI-H状态占散发性结直肠癌的10%～15%，遗传性非息肉病性结直肠癌患者中，90%以上存在MSI-H状态［3］。MSI状态的检测具有重要临床意义。MSI检测是林奇综合征筛查的重要方法。对于Ⅱ期结直肠癌患者，MSI状态直接决定其术后复发风险及辅助治疗的临床决策。对于Ⅳ期结直肠癌患者，MSI状态有助于筛查免疫检查点抑制剂治疗的适用人群。目前，MSI检测已被美国国立综合癌症网 络 （National Comprehensive Cancer Network，NCCN）结直肠癌临床实践指南和中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结直肠癌患者［4］。

1998年美国国家癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）推荐对BAT25、BAT26、D5S346、D2S123和D17S250五个位点进行检测，根据微卫星位点不稳定的数量将结直肠癌分为MSI-H（具有两个或两个以上位点改变）、MSI-L（仅有一个位点发生改变）以及MSS（没有位点发生改变）［5］。PCR方法检测微卫星位点是最早确立的鉴别结直肠癌MSI状态的方法，是当前公认的MSI检测的金标准。另一种常用方法是通过免疫组化（immunohistochemistry，IHC）检测MMR基因编码的蛋白，包括MLH1、MSH2、MSH6和PMS2，任一蛋白的表达缺失提示样本为MSI-H，即为dMMR（deficient MMR），蛋白均表达阳性时则为MSS/MSI-L，即为pMMR（proficient MMR）。

MSI状态与结直肠癌临床分期具有一定的相关性，在Ⅱ期结直肠癌中，MSI-H/dMMR患者约占20%，在Ⅲ期结直肠癌中约占12%，而在Ⅳ期中最少，约占4%［6-7］。既往的研究表明与多数MSS/MSI-L/pMMR结直肠癌相比，MSI-H/dMMR结直肠癌具有较为特殊的临床病理特征：（1）肿瘤原发部位多位于右半结肠；（2）女性多见；（3）分化程度较差；（4）黏液成分多见；（5）肿瘤边缘呈膨胀性浸润，T分期较晚，肿瘤浸润淋巴细胞（tumourinfiltrating lymphocytes，TILs）多见，周围可见克罗恩病样淋巴细胞反应（Crohn's-like lymphoid reaction，CLR）；（6）区域淋巴结转移较少；（7）同时发生BRAF突变较多，约占50%，而KRAS突变较少［6，8-12］。可见，MSI-H既有预后良好的，亦有预后不良的临床病理特征。本研究结果显示，MSI-H组患者CEA＜4.7 ng/mL、右半结肠癌、低TNM分期、高T分期、低N分期、低分化、黏液成分、肿瘤直径≥4 cm、无癌结节、无神经侵犯、低LNR所占比例显著高于MSS/MSI-L组患者。MSI-H组淋巴结检出数显著多于MSS/MSI-L组，而阳性淋巴结检出数显著较少。MSI-H与MSS/MSI-L结直肠癌不同的临床病理特征，提示二者的发生发展机制不同，对应的治疗策略可能不同。

淋巴结检出数是结直肠癌手术切除标本的重要病理指标。除了手术切除范围，淋巴结检出数还受到病理检查、患者自身以及肿瘤的生物学特征的影响。既往研究表明，MSI-H与更多的淋巴结检出数相关，与本研究结果相一致。Kang等［13］通过对603例Ⅰ～Ⅲ期结直肠癌患者的资料分析发现，MSIH患者具有更多的淋巴结检出数（中位数：31枚vs.23枚，P＜0.001）。Shin等［8］对245例Ⅱ/Ⅲ期结直肠癌患者的分析发现，MSI-H组淋巴结检出数显著多于MSS/MSI-L组（26.3±13.1枚vs.20.7±1.2枚，P=0.04）。Belt等［14］发现，65例MSI-H型结肠癌患者平均淋巴结检出数10.1枚，267例MSS/MSI-L型患者为8.6枚（P=0.03），多因素分析显示MSI状态是高淋巴结检出数的最强独立影响因素。Berg等［15］回顾了204例Ⅰ～Ⅲ期结肠癌患者的资料，发现79%（53/67例）的MSI-H患者具有足够的淋巴结检出数（≥12枚），MSS/MSI-L组为61%（83/137例）。多元线性回归分析显示MSI是淋巴结检出数的独立影响因素。由于DNA错配修复功能的缺陷，MSI肿瘤中移码突变所产生的截短肽链（truncated peptides）非常常见，其免疫原性诱导机体的抗肿瘤免疫反应增强，促使肿瘤浸润淋巴细胞的大量出现［16］。此外，MSI-H结直肠癌具有一项重要病理特征－CLR，即瘤周淋巴细胞大量聚集成团，星状纤维包绕，部分具有生发中心［17］。CLR与更多、更大的淋巴结相关，预示着较好的预后［18］。抗肿瘤免疫反应越强，淋巴组织增生，淋巴结越大，更加容易被发现［17，19］。MacQuarrie等［20］回顾分析了168例Ⅲ期结肠癌患者的病例资料，发现MSI患者与MSS患者平均淋巴结检出数分别为15.9枚和16.9枚（P=0.664），认为MSI状态不影响淋巴结的检出数目。然而，该研究时间跨度较大，可能存在较大的病例选择偏倚，且未行多因素分析，其结论有待商榷［20］。

本研究作为单中心的回顾性研究，存在一定的选择偏倚。然而，鉴于单中心研究中，手术切除标准、病理检查标准可以得到统一，且本组病例数量较大，所得结论具有一定的临床意义。

综上所述，结直肠癌不同的MSI状态具有特异性的临床病理特征，MSI-H结直肠癌患者既有预后良好的，亦有预后不良的特征。MSI-H结直肠癌的特殊性，决定了其治疗的个体化需求。