基于网络药理学独活寄生汤治疗膝骨关节炎的分子机制

石淇允，谭旭仪，李无阴，卢 敏

(1.湖南中医药大学研究生院，湖南 长沙 410208；2.河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院药物实验室，河南 洛阳 471002)

膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种以膝关节软骨退行性病理改变和继发性骨质增生为基础的疾患，临床上早期症状表现为膝关节疼痛，随着病情进展出现膝关节活动受限，关节畸形、骨摩擦感、肌肉萎缩等[1]。流行病学调查发现KOA在中老年人群发病较多，尤其是在65岁以上人群中发病率可高达50%左右。随着我国人口老龄化的上升趋势，有学者预测到2050年KOA将成为第4大致残性疾病。但病因仍不明确，多认为其发生可能与年龄、炎症、创伤、异常应力等因素密切相关[2]。对其治疗措施主要为缓解症状、矫正膝关节畸形、改善关节功能，延缓疾病的发展进程，提高患者的生活质量[1]。部分指南[1,3]已明确指出常用西药如NSAIDs类药物、镇痛药和SYSADOAs等短期效果显著，但长期服用不良反应较多。

有学者[4]提出中医药治疗KOA虽然效果显著，但其具体作用机制和长期疗效尚无较新高级别的研究证据支持。因此，探究中医药治疗KOA的详细作用机制，可更好的为应用中医药治疗本病提供理论支持。课题组在前期的临床观察和实验研究[5-6]均证实了独活寄生汤能够缓解KOA患者疼痛，抑制膝关节软骨细胞凋亡和炎症反应，改善膝关节功能，但其具体的作用靶点和作用机制尚不明确。因此，本研究运用网络药理学探索独活寄生汤治疗KOA的可能的作用机制，为临床用药提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 药物活性成分的筛选在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索关键词“独活寄生汤(独活，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、人参、当归、白芍、熟地黄、甘草)”获得其活性成分信息，并设置其口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18为筛选条件。

1.2 药物作用靶点预测与疾病靶点查询在TCMSP中进行检索，获取化合物的靶点，并在Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org/)UniprotKB检索功能对各靶点人类基因简称进行查询转化，获取独活寄生汤中可能存在的相关基因靶点。在GeneCards数据库(https://auth.lifemapsc.com)中以“knee osteoarthritis”为检索词进行检索，获取KOA的已知相关基因。

1.3 共同靶点的确定在相关网站(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)中导入药物作用靶点和疾病作用靶点的相关基因数据，并绘制Venny图获取药物(独活寄生汤)靶点与疾病(KOA)靶点的交集为共同靶点。

1.4 成分-靶点网络构建将确定的药物疾病共同靶点导入Cytoscape3.7.2(美国)构建“成分-靶点”网络图。使用Cytoscape3.7.2中网络分析(Network analyzer)功能，对节点连接度(Degree)、介度(BC)和紧密度(CC)进行分析，以获取独活寄生汤治疗KOA的主要活性成分。

1.5 蛋白相互网络的构建将取交集后的靶点导入在线系统String11.0(http://string-db.org/)，获得蛋白质相互作用(PPI)网络，并将相关参数保持默认设置，筛选出网络中的关键靶点。

1.6 生物通路的分析对独活寄生汤中的有效作用靶标进行基因本体论(GO)分析与京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，得到通路富集结果，将相关筛选标准设置为P<0.01，筛选出有明显意义的通路并进行排名，将较为靠前且具有临床意义的通路进行描述。

2 结果

2.1 独活寄生汤的活性成分及相应靶蛋白共检索出1 600种独活寄生汤所含的有效活性成分，去重后得到符合标准的成分154种(Tab 1)。有效活性成分数量最多的是槲皮素，山奈酚和β-谷甾醇等化合物(Tab 2)。

Tab 1 Statistics of drug-active ingredients-target information

Tab 2 Active pharmaceutical ingredients of Duhuo Jisheng decoction

2.2 药物靶点预测及共同靶点的确定在Uniprot 数据库中共得到130个基因靶标。在GeneCards数据库(https://auth.lifemapsc.com)中获取创已知的疾病靶点1 878个。取两者交集为共同靶点，共63个(Fig 1，Tab 3)。

Fig 1 Common target

2.3 成分-靶点与疾病靶点网络将预测的63个蛋白构建网络图并分析发现共有靶蛋白的节点202个，表示相互作用的线868条，成分-靶点网络图节点连接度的均值为8.59，中位数为5。槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄连素、黄芩素、β-胡萝卜素、甘草查耳酮A、异鼠李素这8种成分的度值均大于所有度值的2倍中位数(Tab 4)，而度值越大说明这些成分与靶点的关联数量越多，因此可以推测这些成分是独活寄生汤治疗KOA的主要活性物质。

Tab 3 Potential target

Tab 4 Topological parameters of main active ingredients

2.4 蛋白质相互作用网络构建使用String数据库获取独活寄生汤治疗KOA相关靶标的相互作用关系，导入String数据库，构建PPI网络图并进行分析发现共有节点62个，线690条，平均节点度值为22.25，度值中位数为20。IL6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC这7个靶点的度值均大于所有度值的2倍中位数，而度值越大说明这些成分与靶点的关联数量越多(Fig 2)。

Fig 2 Core protein in protein interaction network diagram

2.5 GO生物学功能分析将63个潜在靶点映射到DAVID数据库中，进行生物学功能富集，共富集到68条生物过程，筛选出独活寄生汤治疗KOA的P值最小的前42个生物学功能并绘制其气泡图(Fig 3)。其中P<0.01 的生物过程共有41条。

2.6 KEGG通路分析运用R语言对所有靶点进行KEGG通路富集分析共筛选出117条相关通路，对P值最小的20条通路绘制相关条形图(Fig 4)。有91(P<0.01)条通路与独活寄生汤治疗KOA的作用相关，如：hsa05210(Apoptosis)、hsa04933(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、hsa04668(TNF signaling pathway)等基因通路。

Fig 3 GO function enrichment analysis bubble chart1：DNA-binding transcription activator activity,RNA polymerase Ⅱ-specific;2：nuclear receptor activity;3：transcription factor activity,direct ligand regulated sequence-specific DNA binding;4：RNA polymerase Ⅱ transcription factor binding;5：ubiquitin-like protein ligase binding;6 ：endopeptidase activity;7 ：steroid hormone receptor activity;8 ：steroid binding;9：ubiquitin protein ligase binding;10 activating transcription factor binding;11 integrin binding;12 ：kinase regulator activity;13：cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process;14：repressing transcription factor binding;15 ：histone deacetylase binding;16 ：cysteine-type endopeptidase activity;17 ：protein phosphatase binding;18 ：nuclear hormone receptor binding;19：protein kinase regulator activity;20 ：cysteine-type peptidase activity;21 ：phosphatase binding;22：hormone receptor binding;23：estrogen receptor binding;24：transcription cofactor binding;25：E-box binding;26 ：p53 binding;27 ：SMAD binding;28 ATPase binding;29 ：steroid hormone receptor binding;30 ：protease binding;31 ：heme binding;32 ：growth factor binding;33 ：RNA polymerase Ⅱ basal transcription factor binding;34 ：transcription coactivator binding;35：NF-kappaB binding;36 ：Hsp90 protein binding;37：cyclin-dependent protein serine/threonine kinase regulator activity;38：RNA polymerase Ⅱ activating transcription factor binding;39 ：core promoter binding;40 ：glutathione binding;41 ：oligopeptide binding;42 ：MAP kinase activity.

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis bar chart1 ：AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications;2 ：Fluid shear stress and atherosclerosis;3 ：Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection;4：Colorectal cancer;5 ：Apoptosis;6 ：Apoptosis - multiple species;7 ：TNF signaling pathway;8：Prostate cancer;9 ：Hepatitis B;10 ：Measles;11 ：Salmonella infection;12 ：Legionellosis;13 ：Human cytomegalovirus infection;14 ：Epstein-Barr virus infection;15 ：Prolactin signaling pathway;16 ：Proteoglycans in cancer;17：Platinum drug resistance;18：Pertussis;19：Toxoplasmosis;20：Pathogenic Escherichia coli infection

3 讨论

3.1 基础理论探析不同的学者根据KOA的发病特点，对该病从多个方面进行治疗。如邢振龙等[7]从“肝、脾、肾”论治KOA；邝高艳[5]等也曾提出“毒、瘀”是KOA的主要病机；马浩哲等[8]提出从“虚、瘀”论治KOA；而谭旭仪等[9]总结多数医家的理念认为“虚、毒、瘀”是KOA的主要病机，并选用独活寄生汤治疗KOA，疗效显著。独活寄生汤[10]最早被《备急千金要方》收录，是骨伤科常用方剂之一，该方由独活，桑寄生、杜仲、牛膝、细辛、秦艽、茯苓、肉桂、防风、川芎、人参、当归、白芍、熟地黄、甘草这15味中药组合而成，以独活、桑寄生为君药，具有补肝肾、祛风湿和止痹痛的临床疗效。

3.2 有效成分研究本研究运用网络药理学的方法，从有效成分、通路和基因蛋白等方面综合探索评价独活寄生汤治疗KOA的作用效果。对独活寄生汤的活性成分和KOA相应的靶标进行搜索、筛选，得到符合标准的有63个。进一步构建“药物-成分-靶点-疾病”的网络图发现槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素、甘草查耳酮A、异鼠李素这8种成分与治疗疾病的相关性较高，结合文献报道及实验室研究总结[11-12]发现，这些有效成分主要与调控成骨或软骨细胞的代谢平衡、抗氧化、改善内环境的炎症反应等机制密切相关。如槲皮素能够抗炎、抗氧化，也有研究[11]证实了槲皮素具有促进成骨分化的作用，同时抑制骨吸收。袁真等[12]通过实验证实了山奈酚能够增加骨密度，改善骨微结构。因此，独活寄生汤治疗KOA的主要有效成分可能为槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素、甘草查耳酮A、异鼠李素。

3.3 基因表达浅析对本研究PPI网络分析可知，IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC这几种蛋白质超过所有度值的2倍中位数，这说明独活寄生汤的活性成分与这些蛋白具有较高的结合活性。检索相关文献发现IL-6(interleukin 6)是一种内源性热原，能够在自身免疫性疾病或感染患者中引起发热。这种蛋白质与多种炎症相关疾病状态有关，在炎性部位它被分泌到血清中，并通过白细胞介素6受体α诱导转录形成炎症反应[13]。VEGFA(vascular endothelial growth factor A)是一种与血管新生有关的因子，该生长因子能够诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，同时与炎性指标、疾病活动及功能指标具有正相关，也可参与固有免疫调节[14]。ALB(albumin)在调节血浆胶体渗透压中起作用，并充当多种内源性分子(包括激素，脂肪酸和代谢产物)以及外源性药物的载体蛋白[15]，可能与KOA发生肿胀等密切相关。以上也证实了通过PPI网络所筛选的靶点蛋白的确与KOA的发生发展密切相关。因此，IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC可能为独活寄生汤治疗KOA的关键靶点蛋白。

3.4 生物学功能和信号通路探索从GO功能富集结果分析可知，独活寄生汤治疗KOA的潜在靶点多与炎性细胞因子的调控和骨与软骨细胞的代谢等生物学过程相关。复习相关文献[16]可知在正常生理情况下，炎性细胞因子(如hs-CRP、IL-6等)及骨与软骨细胞的代谢物质(CASP3、MAPK8、MYC等)在KOA的发病过程中具有重要的影响及调节作用。而膝关节软骨的退变、半月板及周围软组织损伤、下肢力线异常等可导致IL-6、hs-CRP等炎性细胞因子和MMPs、CDK4、BMP-2、CASP3、MAPK8等细胞因子含量的异常，这些细胞因子可以诱发多种凋亡诱导信号，破坏软骨细胞的正常代谢，导致关节软骨和半月板退变。KEGG 通路富集分析结果可知，在独活寄生汤治疗KOA的过程中主要涉及的通路可能是与代谢相关通路、肿瘤坏死因子相关通路、炎症感染相关通路及细胞调控相关通路。如在AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications中衰老和氧化作产生AGEs，AGEs作用于模式识别受体RAGE(免疫球蛋白超家族)AGE/RAGE信号可激活涉及NADPH氧化酶、蛋白激酶C和MAPK的多种细胞内信号通路，进而导致NF-kappaB活性。NF-kappa B促进IL-1、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子和VCAM-1、组织因子、VEGF、RAGE等多种炎性基因的表达。此外，JAK-STAT介导的和PI3K-Akt依赖的途径是通过RAGE诱导的，RAGE又分别参与细胞增殖和凋亡[17]。而Apoptosis是典型的调节细胞凋亡的通路，通常细胞凋亡是一个通过激活半胱氨酸蛋白酶(天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶)消除受损或多余细胞的基因程序化过程。细胞凋亡的发生受许多相互关联的过程控制，多种外源性化合物刺激位于细胞表面的肿瘤坏死因子(TNF)受体亚家族成员，后分别通过其特定的配体，如TNF-α、FasL或TRAIL等可导致细胞凋亡。或由于细胞内环境的改变导致DNA损伤、内质网应激、代谢应激或生长因子剥夺导致细胞色素c的释放，激活caspase家族成员(如caspase-3和caspase-7)分泌增多，导致细胞死亡[18]。因此独活寄生汤治疗KOA可能通过调控 AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、IL-17 signaling pathway、TNF signaling pathway等信号通路，促使促凋亡和抗凋亡信号之间的平衡，减少炎症细胞因子的分泌，延缓或改善关节软骨的退变。

3.5 展望与不足本研究通过网络药理学和整合生物信息学方法，对独活寄生汤治疗KOA的物质基础及其作用机制进行探析。从独活寄生汤中共获得有效生物活性成分154种，活性成分-靶点互作网络中，degree值较高槲皮素、汉黄连素、黄芩素、β-谷甾醇、β-胡萝卜素、甘草查耳酮A、异鼠李素、山奈酚，可能在独活寄生汤的药理作用过程中发挥重要作用。预测的63个蛋白中可作为KOA核心治疗靶点的有IL-6、VEGFA、ALB、EGFR、CASP3、MAPK8、MYC等。这些靶点主要包含炎性细胞因子的调控和骨与软骨细胞的代谢等生物学过程，涉及到炎性细胞因子的调控和骨与软骨细胞的代谢等过程的有AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Apoptosis、TNF signaling pathway 等多条信号通路。这均证实了独活寄生汤能够多成分、多途径、多靶点的调控KOA的发展进程，这也为证实中药治疗疾病的科学规范化提供了新的思路。