MPAD 对老化皮肤损伤愈合的促进作用

金美华，李维龙，练旭冬，贺鑫梅，陈艳，申贵男，韩英浩

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆163319）

2017 年国家统计局公布最新人口数据，60 岁及以上人口占总人口的17.3%，占全球老年人口的总量的1/4，我国将面临未富先老的困境的同时，衰老相关疾病也将接踵而来[1-3]。皮肤作为人体的重要器官，结构复杂，功能多样，不仅是体内脆弱组织与外界环境之间的坚实壁垒，同时还发挥着维持体温、保存水分、感觉和免疫监视等作用[3-4]。衰老的皮肤将经历结构和功能上的退化，表现出皮肤松弛、色素沉积等现象，这不仅会使皮肤的美观程度大打折扣，而且会使皮肤更容易受到外来伤害[5]。绝大部分的皮肤老化起始于真皮层，表现为真皮层变薄、胶原含量减少，主要原因是成纤维细胞数量的减少及功能的下降。真皮成纤维细胞结构和功能的变化导致老化皮肤更容易受到损伤且损伤后更加难以愈合[6]。因此寻找一种治疗老化皮肤损伤愈合的药物迫在眉睫。

我国天然紫草提取物具有良好的抗菌[7]、抗炎[8]、抗癌[9]、抗疟疾[10]以及延缓机体衰老的作用[11-12]。有研究表明紫草提取物具有抗脂质过氧化、清除自由基从而延缓衰老的作用，并且主要成分为紫草的软膏已应用于临床治疗皮肤的烧伤、水火烫伤[13-14]。但是紫草有效成分很多，成分复杂，相关治疗机制并不十分明确，而紫草的主要成分萘醌类化合物对细胞的毒性作用较大，萘醌类化合物治疗皮肤损伤愈合相关研究较少，并无治疗老化皮肤损伤愈合药物的相关报道。因此，实验室以紫草的主要成分1，4 二甲氧基苯为起始物，以增强其优良的生物活性为目的，设计并合成2-异丁胺基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌（MPAD）用于老化皮肤损伤愈合的实验研究，明确MPAD 与老化皮肤损伤愈合之间的关系，阐明MPAD治疗老化皮肤损伤愈合的相关分子机制，为紫草类衍生物对老化皮肤损伤的治疗提供理论依据，为老龄动物的皮肤损伤治疗提供候选化合物，为临床治疗老化皮肤损伤提供新方法和思路，对皮肤损伤疾病的治疗具有潜在的价值与意义。

1 材料与方法

1.1 试剂

苏木精、伊红，索莱宝公司；TE、FBS，Gibocol 公司；DMEM、HBSS，Hyclone 公司；无水乙醇、二甲苯，泉瑞试剂公司；1，4-二甲氧基苯、马来酸苷，阿拉丁公司；无水三氯化铝，麦克林公司。

1.2 材料仪器

小型台式冷冻离心，1-15K，Sigma 公司；冷冻真空干燥机，F0-1B-55，北京博医康实验仪器有限公司；病理组织切片机、包埋机、摊片机，Leica 公司；超白载玻片、盖玻片，上海世泰公司；高速离心机购自湘仪仪器公司。

1.3 实验动物

5 只10 月龄SPF 级体重相似的129/SvJ 健康小鼠，自由饮食与饮水。129/SvJ 品系小鼠由黑龙江八一农垦大学，疾病模式动物研究中心提供。

1.4 细胞

由野生型129/SvJ 小鼠提取的小鼠原代真皮成纤维细胞。

1.5 方法

1.5.1 MPAD 合成过程

以1，4-二甲氧基苯为起始物，通过傅克反应、甲基化反应及氧化反应得到中间体5，8-二甲氧基-1，4-萘醌，利用2-甲基丙胺通过迈克尔加成反应得到MPAD（下图为MPAD 的合成路线）。

1.5.2 H&E 染色

用颈椎脱臼法处死小鼠，对小鼠背部伤口部位的皮肤进行标记并取样，将皮肤样品放入福尔马林中24 h，水洗（1.5 h），组织脱水机脱水（9.5 h），包埋机包埋，冷动台冷冻，将蜡块放于-20 ℃冰箱保存。组织切片机切片并将切好的组织平摊到载玻片上（组织厚度为5 μm），自然干燥2 d，进行脱蜡及H&E 染色。具体过程如下：二甲苯（10 min）；二甲苯（10 min）；100%酒精（1.5 min）；90%酒精（1 min）；80%酒精（1 min）；50%酒精（1 min）；水洗（3 min）；苏木精（5 min）；水洗（3 min）；酸性乙醇（2 s）；水洗（3 min）；0.8%氨水（2 s）；水洗（5 min）；伊红（20 s）；90% 酒精（1 min）；95%酒精（1 min）；100%酒精（1 min）；二甲苯（3 min）；中性树脂封片。

1.5.3 小鼠原代真皮成纤维细胞的提取

取1～2 d129/SvJ 新生小鼠，75%酒精浸泡消毒杀菌（2 min），含庆大霉素HBSS 浸泡（2 min），去除小鼠头部、尾部及四肢，沿腹中线将小鼠皮肤剪开，取下小鼠皮肤并剔除皮肤中血管及脂肪，将皮肤剪成3 mm 大小并贴在培养瓶的底部，翻转培养瓶后放置于37 ℃二氧化碳培养箱（2.5 h），添加培养液，3 d 后更换培养液，一周后传代，冻存备用。

1.5.4 SA-β-gal 染色

将真皮成纤维细胞以10 万个每孔种在3.5 cm培养皿；24 h 后弃上清液后PBS 清洗一次；加入2 mL 0.5%戊二醛溶液，避光孵育20 min；2 nM PBS 洗液清洗一次；加入2 ml 染色液，37 ℃培养箱（无CO2）孵育2 d 后照相。

1.5.5 流式细胞术检测ROS

真皮成纤维细胞以每板3×105个细胞种于3.5 cm培养皿中。24 h 后换液并进行加药处理，对照组加入等体积的PEG，48 h 后回收细胞，PBS 清洗一次，加入10 mmol·L-1的CM-H2DCFDA，二氧化碳培养箱中孵育10 min，离心后弃掉上清液体，用PBS 重新吹打悬浮后转移到流式管中，通过流式细胞仪检测其荧光强度。每组均重复3 次。

1.5.6 统计学分析

试验数据以“平均值±标准差”表示，组间差异采用t 检验，以P<0.05 为差异有显著性。

2 结果

2.1 MPAD 促进小鼠皮肤损伤愈合

为研究MPAD 是否具有加快皮肤损伤愈合的作用，通过小鼠皮肤线性伤口造模，局部涂抹MPAD（浓度分别为1、10 μm·L-1），对照组涂抹溶剂PEG 处理，并分别在第0、3、5、7 d 照相观察伤口愈合的情况（如图1）。实验结果证明MPAD 可以促进小鼠皮肤损伤的愈合，并成浓度依赖性。经病理组织切片、HE 染色分析局部涂抹后对伤口愈合影响（如图2）。实验结果表明，药物处理组伤口愈合情况明显好于对照组。

图1 创伤后第0、3、5、7 d 观察创伤愈合情况Fig.1 Observed healing results on day 0，3，5 and 7 after the trauma

图2 H&E 染色分析伤口愈合情况Fig.2 H&E staining analysis of wound healing

2.2 MPAD 可以延缓小鼠原代真皮成纤维细胞的衰老来维持细胞良好状态

为探究MPAD 与老化皮肤损伤愈合之间关系，实验利用SA-β-GAL 染色对小鼠原代真皮成纤维细胞的衰老情况进行分析。真皮成纤维细胞在皮肤损伤愈合过程中极为重要，真皮成纤维细胞增殖迁移填充伤口部位的速度与时间决定着皮肤损伤愈合的速度。当真皮成纤维细胞衰老后，其生理功能发生改变，增殖、迁移能力下降，并且在创伤形成后的氧化应激会促进细胞的衰老，影响细胞的正常功能，这也导致了老化皮肤损伤极难愈合。因此，实验采用小鼠原代真皮成纤维细胞进行试验，药物处理组浓度为800 nmol·L-1，对照组加入等体积的PEG。实验结果发现，与对照组相比，MPAD 在处理组真皮成纤维细胞衰老得到了抑制，并且随着细胞代数的增长，这一现象更加明显，证明MPAD 可以有效的延缓真皮成纤维细胞的衰老（图3 为X-Gal 染色结果，图4 为图3的定量分析）。

图3 MPAD 对小鼠原代真皮成纤维细胞（4 P、5 P、6 P）衰老影响Fig.3 Effects of MPAD on senescence of primary dermal fibroblasts（4 P，5 P，6 P）in mice

图4 图3 的统计学分析Fig.4 Statistical analysis of figure 3

2.3 MPAD 可以降低小鼠原代真皮成纤维细胞内ROS 的表达

为探究MPAD 影响老化皮肤损伤愈合的原因，以及MPAD 抑制小鼠原代真皮成纤维细胞衰老的机制，实验通过流式细胞术检测MPAD 对小鼠原代真皮成纤维细胞内ROS 水平的影响。当发生皮肤损伤后，ROS 的含量会大量增高，ROS 是造成细胞衰老的主要因素，而皮肤老化恰恰导致了伤口难以愈合。因此，实验通过流式细胞术检测MPAD 对ROS 水平的影响。MPAD 处理组浓度为800 nmol·L-1，对照组加入等体积的PEG，分别处理小鼠原代真皮成纤维细胞。实验结果发现MPAD 可以有效地降低真皮成纤维细胞内的ROS 水平。当创伤形成时ROS 的水平会明显升高并且老化的皮肤中ROS 水平相对较高，对皮肤的愈合功能造成不利影响。实验证明MPAD 可以降低小鼠真皮成纤维细胞内ROS 的水平，抑制真皮成纤维细胞衰老，从而维持真皮成纤维细胞良好的状态，加速皮肤损伤的愈合。

图5 流式细胞术检测MPAD 对小鼠原代真皮成纤维细胞内ROS 表达水平的影响Fig.5 Effects of MPAD on ROS expression in primary dermal fibroblasts was determined by flow cytometry

3 讨论

经久不愈的伤口，不仅给老年人身体行动上造成困扰，并给他们上心灵造成难以言喻的伤害，甚至使一个家庭为其担忧。皮肤损伤包括术后伤口、擦伤、褥疮、糖尿病性溃疡等，皮肤损伤愈合过程也极为复杂。包括早期止血、创面保护、炎症控制及多种组织细胞增生，新生血管的形成，创缘的爬行收缩等[15-16]。皮肤老化的过程中，真皮成纤维细胞具有很重要的作用，其通过增殖、迁移填充伤口区域，释放胶原蛋白、弹性蛋白收缩伤口区域，减少伤口面积来促进损伤愈合[17]。当皮肤老化后，真皮层逐变薄，弹性下降，韧性下降，受到外来伤害时更容易出现损伤，且真皮成纤维细胞发生衰老后，其增殖速度、迁移速度显著下降，导致其愈合速度显著降低，甚至经久不愈引发溃烂威胁我们的生命健康[18-19]。而在皮肤老化与皮肤损伤愈合的过程中，ROS 扮演着极其重要的角色[20-21]。

随着研究的不断深入，越来越多的研究表明ROS 在衰老过程中的重要性[22-23]，甚至有报道称ROS是肌体衰老的罪魁祸首[24]。ROS 主要包括超氧阴离子和羟基自由基等，是造成核酸、脂质和蛋白质损伤的主要物质，也是导致皮肤老化的主要元凶[25-27]。同时，ROS 与皮肤损伤愈合之间关系也十分密切，甚至被认为调控着伤口愈合的全部过程[28-29]。当皮肤受到外界刺激发生损伤后，受伤部位ROS 含量也会大量增加，这也间接导致老化皮肤的损伤难以愈合。而目前治疗皮肤损伤的药物有很多，但老化皮肤其皮层结构与功能已发生变化，细胞功能受损，致使普通治疗药物药效不明显。

紫草是我国中草药的一种，广泛应用于烧烫伤，具有抗炎、抑菌的良好效果，并且紫草与ROS 之前密切相关。紫草主要活性成分是萘醌类化合物，但是萘醌类化合物毒性很强，很难应用于临床，因此我们实验室以紫草的提取物1，4 二甲氧基苯为起始物，以增强其优良生物活性及清除ROS 的能力，降低其毒副作用为目的，对化合物进行构效分析，筛选有效的取代基，并对萘醌类衍生物进行设计与合成。已有研究结果显示萘醌类化合物的5，8 位羟基是产生细胞毒性的主要基团[30-32]。在分析萘醌类化合物细胞毒性的化学结构基础上，我们以1，4-二甲氧基苯为起始物，通过甲基化、傅克反应和氧化反应合成了中间体5，8-二甲氧基-1，4-萘醌。为研究2 位取代基对清除活性氧的影响，又通过迈克尔加成反应合成了一系列2-取代衍生物，对其细胞毒性及活性氧清除作用进行了评价，发现异丁胺基-5，8-二甲氧基-1，4-萘醌活性最强，并且产生较强的清除ROS 能力，而皮肤老化正是由ROS 所引起，因此，我们根据前期研究结果，发现MPAD 良好的清除ROS 能力及其生物学活性，探究MPAD 对老化皮肤损伤愈合的影响。

结果表明，MPAD 处理后老龄小鼠伤口愈合速度明显加快。通过X-Gal 染色发现MPAD 处理后小鼠原代真皮成纤维细胞的衰老得到了明显的抑制。因此推测MPAD 加速老化皮肤的损伤愈合是通过延缓细胞的衰老，维持细胞良好的状态实现的。ROS 是皮肤老化的元凶之一，并且在伤口发生时会产生大量的ROS 导致氧化应激延误伤口的愈合。通过流式细胞术检测后发现MPAD 可以降低小鼠原代真皮成纤维细胞内ROS 的水平。结果表明，MPAD 可以通过降低小鼠真皮成纤维细胞内ROS 水平延缓衰老，维持细胞自身良好状态，从而促进老化皮肤的损伤愈合。研究为萘醌类衍生物抗衰老、促进伤口愈合提供基础，为老化皮肤损伤的治疗提供理论理论依据，为衰老相关疾病的治疗提供方向。