白芨种子在3种介质上萌发及生长比较

赵垚　曹小勇　杨国鹏　胡选萍　蒋景龙　秦公伟

摘要：以MS固体培养基、液体培养基和泥炭基质为培养介质，利用体视显微镜观察并拍照比较白芨种子在3种介质上萌发及生长发育的差异。结果表明：（1）种子在固体培养基和泥炭基质上萌发过程相似，顺次形成绿色原球茎-叶片-不定根;在泥炭基质上不定根及假鳞茎发生均迟于固体培养基，但叶片生长较快，当不定根在茎节基部发生时原球茎基本消失;（2）在液体培养基中种子萌发后，原球茎膨大形成类似假鳞茎的储藏性结构;播种15d后统计发现，白芨种子在固体培养基中萌发率为80.67%，液体培养基中为89.33%，泥炭基质中为62.67%。结果表明，3种不同培养基质的发育模式存在差异，白芨原球茎是一种类似胚胎的结构，在后续发育中可以消失，也可以形成储藏性结构;MS液体培养基培养在不转接情况下可得到大量原球茎，MS固体培养基和泥炭基质培养均可得到白芨幼苗，泥炭基质培育过程简单，可大量繁殖。

关键词：白芨;原球茎;泥炭;真根;假鳞茎;MS培养基;泥炭基质

中图分类号：S567.23+9.01文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2021）04-0087-06

作者简介：赵垚（1994—），女，陕西汉中人，硕士研究生，主要从事植物生物技术研究。E-mail：752601809@qq.com。

通信作者：曹小勇，硕士，教授，硕士生导师，主要从事植物生物技术研究。E-mail：caoxyong@163.com

白芨[Bletillastriata（Thunb.）Reichb.f.]为兰科白芨属多年生宿根草本植物，其花大色艳，且有肥厚肉质的可供药用的块茎，具有收敛止血，消肿生肌等功效，用于治疗咯血、吐血、外伤出血、疮疡肿毒、皮肤皲裂等症状[1]。白芨不仅药用价值高，观赏价值也高[2]，也是我国现代医药工业[3]和化妆品工业的重要原材料[4]。目前白芨种苗繁殖有3种方式：（1）分株繁殖，这是种植户采用的主要繁殖方式，利用无性繁殖方式逐步积累种苗，该方式存在繁殖速度慢、繁殖系数低、耗种量大，还与用药争夺原料等问题，长期无性繁殖引起病原体积累、种质退化[5];（2）植物组织培养，主要以种子在固体培养基上无菌萌发形成幼苗[6]，或先利用液体悬浮培养得到大量原球茎，再转移至固体培养基培养，形成幼苗[7-8];（3）种子繁殖，白芨种子非常细小且数量巨大，但成苗时间长，影响因素多，稳定性差，成苗率低[9]，因此在自然条件下白芨种子繁殖较少[10]。

目前，袁宁等对白芨种子在固体培养基上的无菌萌发进行了报道，利用白芨种子在固体培养基中的萌发得到白芨试管苗，经炼苗、移栽得到白芨幼苗[6，11-14]。王楷等对白芨种子在液体培养基中的萌发过程也进行了报道，主要利用白芨种子在液体培养基中萌发得到原球茎，再转接至相应的固体培养基中成苗，最后进行炼苗、移栽，形成白芨幼苗，但未对原球茎后续发育进行观察[7-8]。另外白芨种子在泥炭中萌发生长变化的过程未见报道。鉴于此，本研究在建立白芨种子离体培养（包括MS固体、液体培养）的基础上，与泥炭中白芨种子的萌发过程进行比较观察，以了解白芨种子在不同培养基质中发育模式的差异，探讨白芨种子适宜的播种基质，为进一步了解兰科植物种子萌发生物学特性积累资料。

1材料与方法

1.1材料

本研究所用白芨蒴果于2018年9月采自陕西省汉中市留坝县（33°37.516′N，106°54.958′E），海拔（972.2±6.2）m的白芨栽培基地，采摘后放入牛皮纸袋，5℃冷藏待用。

1.2种子在3种培养介质中培养及观察

本试验于2019年5月在陕西理工大学生物科学与工程学院组织培养室进行，选取白芨未开裂蒴果用75%乙醇处理60s，10%NaClO溶液处理20min后，用无菌水冲洗3次。本试验采用的基本培养基为MS培养基，加入25g/L蔗糖（固体培养基加7g/L琼脂），pH值5.8～6.0。无菌条件下将约100粒种子分别接入MS固体培养基和液体培养基中，每个处理重复4次，液体培养基进行静置培养;泥炭基質是在20cm×20cm的塑料盆中均匀铺1层厚约1.5cm的丹麦Pindstrup泥炭土（直径0～10mm），将约300粒种子均匀散布在泥炭表面，喷水，用保鲜膜封住塑料盆口。所有处理的培养温度为（25±2）℃，光照度为（2500～3000）lx，光照时间为12h/d。在培养7、15、30、45、60、120、150d时用LeicaM205C体视显微镜观察并拍照记录发育过程。15d统计白芨种子萌发率，取约50粒种子进行测量统计萌发变绿的种子数量，各重复3次;计算公式：萌发率=（萌发种子数/50）×100%;15d后测量不同处理原球茎大小、叶片长度及真根长度，每个处理每次取样30个，重复3次。

1.3数据处理

试验结果用Digimizer进行数据测量，使用SPSS21.0进行数据统计分析。

2结果与分析

2.1白芨种子在3种介质上的萌发生长

种子在3种介质上萌发初期的发育过程相近，白芨种子细小呈纺锤形，种胚呈淡黄色，处于原胚阶段，培养3d后种胚转变为淡绿色（图1-A），7d后绝大多数种胚变绿、突破种皮并在原球茎基部出现假根（图1-B）;15d时原球茎顶端生长锥逐步发育形成叶原基，平均长度0.4mm，其长度约是原球茎直径的1/2。

2.2白芨种子在3种培养基质中发育过程比较

白芨种子在3种培养基质中的发育过程见图2、表1，白芨种子接种15d，3种培养基质中的种子均已发育成原球茎，并且长出叶原基（图2-A、图2-B、图2-C），液体培养基中原球茎及叶片均明显小于固体培养基和泥炭基质;此时，统计白芨种子萌发率：固体培养基为（80.67±3.06）%，液体培养基为（89.33±6.43）%，泥炭基质为（62.67±5.03）%;接种后30d，原球茎快速增大，叶片增长，其中液体培养基原球茎增幅最大，达到242%，原球茎直径已超过固体培养基和泥炭基质;泥炭基质中叶片生长最快，增幅达496%，显著高于MS培养基（P<0.05）;接种后45d，3种介质中原球茎大小相近;叶片生长差异较大，与接种30d相比，叶片在泥炭基质中生长最快，其次是固体培养基，液体培养基中生长最慢，仅增长了22%;同时，固体培养基和泥炭基质中白芨均发育出真根（图2-D、图2-F），但在固体培养基中真根长度和数量均大于在泥炭基质中，而液体培养基中没有真根出现（图2-E）;接种后60d，MS液体培养基原球茎持续增大（图2-H），而泥炭基质中原球茎逐渐消失（图2-I）;液体培养基中叶片比固体培养基和泥炭基质中明显较短（图2-H）;真根在固体培养基中生长迅速，与45d相比，增长了1.6倍，生根率达到84.2%（图2-G），泥炭基质中真根生长缓慢，生根率仅21.4%，后期统计发现，80d时泥炭基质中生根率达到81.1%，液体培养基中没有典型真根出现（图2-H）。

2.3白芨种子在3种培养基质中后期生长状态

观察白芨种子培养后期发育过程，种子在液体培养基中叶片生长受限，不定根很少发生，原球茎及叶片持续膨大，形成肉质、半透明状态;一些形成增殖（图3-A），类似分蘖现象;在液体培养基中偶然会出现少数个体，形成叶片及不定根（图3-B），这种情况推测是在培养早期种子贴附在培养容器壁上，改变了个体发育模式造成的。如图3-C、图3-D所示，泥炭基质培养150d时开始出现二级生长点，二级生长点的出现伴随早期叶片的衰老死亡，原球茎上最早形成的叶片最先开始衰老，接着是第2片叶，以此类推，此时假鳞茎出现率超过90%;白芨种子在固体培养基中培养120d时三角瓶中的固体培养基即将耗完，部分白芨幼苗基部原球茎消失，但多数存在，无假鳞茎出现。

将液体培养呈膨大状原球茎播种到泥炭基质上时，在其顶部形成一个或多个新的子代原球茎（图4-A），伴随子代原球茎生长，原来膨大状母原球茎整体衰老死亡（图4-B）。白芨种子泥炭培养后期，生长良好。

3结论与讨论

MS培养基营养丰富，能够在植物胚、原球茎等培养中取得较好效果[15]，液体培养基适用于植物细胞悬浮培养[16-17]，泥炭土含有丰富的有机质，可以作为细小种子萌发的基质。利用MS固体培养基培养白芨种子的报道很多，张燕等研究发现，白芨种子萌发时首先种胚吸水膨大，颜色转绿，进而突破种皮形成原球茎，原球茎长出叶片和根，部分原球茎转变为根状茎，最后成苗[11，18]。聂宁等通过细胞组织学观察白芨種子的萌发过程，提出白芨种子的发育过程要经过种胚、原球茎、根状茎和假鳞茎4个阶段[19]。本研究观察了白芨种子在不加激素的培养介质中发育的过程发现，首先白芨种子种胚吸水膨胀，接着种胚转绿并且突破种皮形成原球茎，叶原基形成并逐渐长出叶片，15d时萌发率达80.67%，

未能100%萌发，可能原因是消毒过程中氯化汞对部分种子毒害较大，少数种子未能接触到培养基表面，吸收营养不够。原球茎增长迅速，当45d左右长出2张叶，同时出现真根，60d时生根率达到84.2%;在固体培养基上由于培养基提供额外营养，白芨种子不定根和假鳞茎发生时间早于泥炭基质上的，不定根发生时原球茎尚未完全消失;而在泥炭上叶片生长速度较在固体培养基上的快;在泥炭上当幼苗形成第3张叶片、原球茎基本消失时，根在茎节基部发生;原球茎消失，意味着原来储藏其中的营养物质已经全部转移。王楷等利用液体培养得到白芨原球茎，进而转接到不同的固体培养基中进行培养，最后得到白芨幼苗，因液体培养可以大量得到白芨原球茎，所以此方法可以快速得到较多白芨幼苗[7-8]。本研究发现，在液体培养基中白芨种子萌发后叶片生长受阻，不定根未发生，原球茎及叶片持续膨大形成肉质、半透明状态;当播种到泥炭上时，顶部形成新的原球茎，随着其生长，原来的母原球茎衰老，这个现象显示，液体中生长形成的膨大状原球茎整体上转变成为储藏性组织，呈现为假鳞茎状态。结果显示原球茎作为兰科植物种子萌发形成幼苗的一个中间形态，其留存时间与个体营养状态有关，也与生长环境相关。

原球茎最早由Treub提出，用于描述石松（club-moss）胚萌发形成下侧具毛的块茎状结构，Balfour将此概念用于表示兰科植物种子萌发形成的小的、球形、块茎状的结构[20-21]。原球茎后续发育形成幼苗有2个途径，一是直接形成幼苗，如附生型兰属植物冬凤兰（Cymbidiumdayanum）;二是转变形成根状茎，然后由根状茎发育形成幼苗，如建兰（C.ensifolium）、春兰（C.goeringii）、墨兰（C.sinense）、纹瓣兰（C.aloifolium）[22]。相关研究者对于原球茎是属于幼苗还是胚仍然存在不同看法，大多数研究者认为是幼苗，如Batygina等也有认为是胚的，郭顺星等也认为是[23]。依据笔者所在课题组对白芨种子萌发的观察，固体培养基及泥炭基质上，叶片直接发育，而在液体培养基中叶片发育成储藏性结构，类似胚的子叶功能，因此可以认为，原球茎是一种过渡性结构，原球茎更接近胚的状态。它反映的是植物发育模式的一个重要特征，即具有更加高的可塑性以应对环境改变。

白芨在生长过程中可以产生大量种子，但种子极微小，结构简单，无胚乳，一般认为不具备自然萌发所需的养分，种子繁殖较困难[24];张建霞等研究发现，白芨种子胚细胞中富含淀粉及大量贮藏物质，这些物质作为种子萌发所需的营养被分解代谢，在种子结构简化，无胚乳的兰科植物种子中，白芨种子是常规条件下容易萌发的类型[25]。李青风对白芨原生地萌发研究发现，白芨种子在室外通过覆土、覆草可与共生菌作用得到白芨幼苗[26]。牛俊峰等选择树皮粉、腐殖质、营养土、鸡粪和草炭土按体积比为15∶20∶8∶1∶5配成的育苗基质，控制空气温度20～35℃、湿度为60%～80%，定期喷洒营养液，白芨种子萌发率可达到69.7%，其所用草炭土就是本研究中的泥炭土[27]。本研究利用泥炭基质进行白芨种子萌发试验，取得良好效果，种子萌发率可达62.67%，略低于牛俊峰等报道的萌发率，但成本更低，过程更加简单。培养30d可形成2张叶，60d叶片平均长度是固体培养基的1.09倍。45d左右真根开始生长，到80d真根率达到80%以上。泥炭中营养物质对比MS培养基较为匮乏，白芨种子萌发变绿后营养来源主要是光合作用，其根的生长速度在一定程度上和叶片生长相关，在出现第2张叶时真根开始生长。泥炭中白芨幼苗在后期继续培养中，120d出现假鳞茎，150d假鳞茎表面出现新的生长点，此生长点发育为另一假鳞茎。1个老的假鳞茎后期可能长出1～3个新的假鳞茎，在其上重新开始分化出叶片和根。同时营养物质偏向于运输至新的分生组织，造成原有的叶从第1张开始衰老死亡。说明白芨种子在泥炭中直接播种可以得到大量白芨幼苗，且不需要像常规离体培养一样进行转接、炼苗，省时省力，简单可行。

综上所述，白芨种子在MS固体培养基中培养，可得试管苗，及时炼苗、移栽可形成白芨幼苗，固体培养基表面干燥，种子吸水较为困难，萌发速度稍慢，流水浸泡3d可使种子种胚吸水膨大，缩短萌发时间。在MS液体培养基中种子吸收营养水分速度最快，具胚种子基本全部可以萌发，接种量大，可在短时间内得到大量原球茎，及时将大量原球茎分装至固体培养基可得试管苗，经炼苗、移栽最终形成大量白芨幼苗，但操作较为繁杂，成本较高。在白芨液体培养成苗技术的研究过程中发现，液体培养最终形成原球茎抑或试管苗与液体培养基深浅有关，本研究所采用的较深液体培养基静置培养，可得大量原球茎，而不能直接得到白芨试管苗;在泥炭基质中白芨种子亦可萌发，萌发率低于MS培养基，培养过程需控制湿度及温度，较MS培养基培养更为简单，且可直接得到大量白芨幼苗，省去炼苗、移栽过程，因白芨果实中含有大量种子，通过提高接种量可增大白芨种苗的得率，即可以通过此法进行白芨种苗的规模化繁殖。

参考文献：

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.

[2]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志（第十八卷）[M].北京：科学出版社，1999.

[3]任华忠，何毓敏，杨丽.白芨化学成分其药理活性研究进展[J].亚太传统医药，2009，5（2）：134-140.

[4]刘光斌，黄忠，黄长干，等.天然植物白芨胶的功能及在化妆品中的应用[J].日用化学品科学，2005，28（8）：22-24.

[5]管常东，叶静，郑晓君，等.白芨组织快繁育苗技术研究进展[J].云南大学学报（自然科学版），2010，32（S1）：416-421.

[6]袁宁.白芨组织培养技术体系研究[D].成都：西南交通大学，2008.

[7]王楷，李玥，张云峰，等.白芨种子的高效萌发及其无性繁殖体系的构建[J].云南师范大学学报（自然科学版），2014，34（4）：71-78.

[8]张宇思，姚正颖，刘金香，等.基于原球茎液体培养的白芨快速繁殖研究[J].江苏农业科学，2015，43（10）：59-62，331.

[9]陈晓芳，刘准，陶刚，等.兰科菌根真菌对黄花白芨种子萌发率的影响[J].西南农业学报，2012，25（4）：1393-1397.

[10]黄春球，宋天顺，李明静，等.外界条件对白芨组织培养的影响[J].安徽农学通报（上半月刊），2010，16（21）：42-43，45.

[11]张燕，黎斌，李思锋.不同培养基上白芨的种子萌发与幼苗形态发生[J].西北植物学报，2009，29（8）：1584-1589.

[12]付志惠，张建霞，李洪林，等.白芨种子萌发与快速繁殖技术的研究[J].武汉植物学研究，2006，24（1）：80-82.

[13]HsuCC，LeeYI.SeeddevelopmentofCypripediumdebileRchb.f.inrelationtoasymbioticgermination[J].Hortence：apublicationoftheAmericanSocietyforHorticulturalence，2012，47（10）：1495-1498.

[14]李雨晴，杨嘉伟，王康才，等.白芨种子无菌萌发特性[J].江苏农业科学，2015，43（4）：253-255.

[15]AsrandinaSS，TashimbayevaA，MamutovaA，etal.MicropropagationofSteviarebaudianaBertoniinKazakhstan[J].CurrentOpinioninBiotechnology，2013，24（S1）：125.

[16]张玉琼，陈娜，周建辉，等.石蒜悬浮细胞系的建立及其生物碱累积的研究[J].中草药，2013，44（24）：3540-3545.

[17]LeePL，ChenJT.PlantregenerationviacalluscultureandsubsequentinvitrofloweringofDendrobiumhuoshanense[J].ActaPhysiologiaePlantarum，2014，36（10）：2619-2625.

[18]崔瑞勤，陈科力，徐雷.基于组培快繁技术的白芨种子萌发和幼苗形态观察[J].江苏农业科学，2015，43（2）：238-240.

[19]聂宁，朱艳，田梅，等.白芨种子萌发及原球茎发育过程的细胞组织学观察[J].中国中药杂志，2016，41（8）：1446-1449.

[20]YamTW，ArdittiJ.Micropropagationoforchidsappendixfour：light[M].NewJersey：JohnWiley&Sons，Ltd，2017.

[21]BatyginaBT，Embryologyoffloweringplants：terminologyandconcepts[J].NewHampshire：SciencePublishers，2009，5（4）：244-248.

[22]ChungMY，ChungMG.PollinationbiologyandbreedingsystemsintheterrestrialorchidBletillastriata[J].PlantSystematicsandEvolution，2005，252（1/2）：1-9.

[23]郭顺星，徐锦堂.白芨種子萌发和幼苗生长与紫萁小茹等4种真菌的关系[J].中国医学科学院学报，1992，14（1）：51-54.

[24]李伟平，何良艳，丁志山.白芨的应用及资源现状[J].中华中医药学刊，2012，30（1）：158-160.

[25]张建霞，付志惠，李洪林，等.白芨胚发育与种子萌发的关系[J].亚热带植物科学，2005（4）：34-37.

[26]李青风.白芨原生地萌发特性及组培苗炼苗技术研究[D].重庆：西南大学，2014.

[27]牛俊峰，王喆之.白芨种子直播繁育新方法[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2016，44（4）：83-86.