醋酸泼尼松片在中国人体内的药动学研究

李庚喜，刘丽芳，李良，刘海艳，周亚丽，杨柳，邓倩，丁劲松（1.中南大学湘雅药学院，长沙 410000；2.邵阳学院，湖南 邵阳 422000；.长沙晶易医药科技有限公司，长沙 410205）

泼尼松是1954年合成的一种糖皮质激素药物[1]。它本身没有生理活性，在体内酶的催化作用生成泼尼松龙而产生药理效应[2-4]。泼尼松和泼尼松龙是一对可逆代谢药物[5]，见图1。它们广泛应用于临床，主要用于各种急性严重细菌感染、严重过敏性疾病、胶原性疾病、风湿病、类风湿关节炎等疾病的治疗[6-9]。

图1 醋酸泼尼松、泼尼松、泼尼松龙体内转化图Fig 1 In vivo transformation of prednisone acetate，prednisone and prednisolone

醋酸泼尼松，为白色或类白色结晶性粉末，是泼尼松的醋酸酯类药物，属国内特有品种。微溶于乙醇或氯仿，几乎不溶于水[10]。研究证实，泼尼松成醋酸酯后，电子云密度增加，从而增加了泼尼松稳定性。醋酸酯泼尼松更容易被胃肠道吸收，在体内能够快速水解[11-12]。经文献调研，醋酸泼尼松在中国人体内转化过程，吸收速度及吸收程度尚不清楚；与相同剂量（同摩尔）的泼尼松龙片在人体内吸收总量（暴露量）尚不明确；中国境内的醋酸泼尼松片说明书的药动学尚不完整，不能满足临床使用过程的剂量调整和剂量变化的需要。因此，阐明醋酸泼尼松片在体内的吸收代谢变化规律，并将其与泼尼松龙进行比较是一件具有重要意义的事情。本文研究了醋酸泼尼松片在中国健康人群的药动学特点，并比较醋酸泼尼松片和泼尼松龙片两者在体内的暴露量情况。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AD XR、岛津8050（日本岛津公司）；SQP/SECURA225D 分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；XW-80A 微型涡旋混合仪（上海沪西分析仪器厂）；海尔超低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；台式高速冷冻离心机TGL 18（长沙英泰仪器有限公司）；超纯水仪GZY-Y40（湖南科尔顿水务有限公司）；超声波清洗器KQ-250（昆山美美超声仪器有限公司）。

1.2 试药

醋酸泼尼松片（山东新华制药股份有限公司，批号：2005402，规格：5 mg/片）；泼尼松龙片（Pfizer AB，批号：X32041，规格：5 mg/片）；泼尼松龙对照品（PNSL）（批号：100153-201405，含量：99.5%）、泼尼松对照品（PNS）（批号：100199-201503，含量：99.6%）（中国食品药品检定研究院）；内标泼尼松龙-d8（PNSL-d8）（Toronto Research Chemicals，批号：15-UPA-67-5，纯度：97.71%）；甲醇（HPLC 级，Merck）；甲酸（HPLC级，ACS）。

2 方法与结果

2.1 血浆中泼尼松与泼尼松龙测定方法的建立

2.1.1 LC-MS/MS 测定条件 色谱条件：分析柱为 ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×75 mm，1.8µm）；流动相A 相为含 0.1% 甲酸水溶液，B 相为甲醇；采用梯度洗脱（0 ～2.60 min，59%B；2.60 ～2.70 min，59% ～95%B；2.70 ～3.50 min，95%B；3.50 ～3.60 min，95% ～59%B；3.6 ～5.0 min，59%B）。流速：0.300 mL·min－1；柱温为40℃；进样量为10 µL。

质谱条件：离子源为电喷雾电离源（ESI源），正离子方式检测，分析模式质谱多反应监测（MRM），接口温度250℃、DL 管温度250℃、加热块温度350℃、雾化气流量3.00 mL·min－1、加热气流量10 mL·min－1、干燥气流量10 mL·min－1。待测物和内标MRM 检测的定量离子反应为：m/z361.20 →147.00（PNSL）、m/z359.10 →147.00（PNS）、m/z369.05 → 151.10（内标PNSL-d8），如图2。

图2 子离子扫描图Fig 2 Mass spectrometry

2.1.2 溶液配制

① 精密称量PNSL 对照品约10.00 mg，经校正因子折算后，加入适量甲醇震荡混匀，配制成含PNSL 10.00 mg·mL－1的储备液。－20℃储存备用。

② 精密称量PNS 对照品约10.00 mg，经校正因子折算后，加入适量甲醇震荡混匀，配制成含PNS 5.000 mg·mL－1的储备液。－20℃储存备用。

③ 将PNSL 和PNS 储备液按比例混合，并用50%甲醇水（V/V）逐级稀释至标准系列溶液所需浓度的标准曲线溶液和质控工作液。－20 ℃储存备用。

④ 以PNSL-d8 作为内标，用甲醇（含0.01%甲酸）稀释至5.000 ng·mL－1，储存在2 ～8 ℃，备用。

2.1.3 血浆样品处理方法 用人混合血浆新鲜配制系列标准曲线溶液；用移液器分别精密移取血浆样本100 µL 至相应的96 孔板中；各孔中加入300 µL 内标溶液（5.000 ng·mL－1），涡旋5 min，2480×g、4℃离心10 min；转移150 µL 上清液至96 孔板中加50.0 µL 蒸馏水稀释；充分混匀，用锡箔纸封膜后放入自动进样器或2 ～8℃冰箱准备进样。

2.1.4 稀释验证样品处理 取10.0 μL 质控工作液，加入190 µL 空白血浆，配制成含PNSL/PNS（500.0/200.0 ng·mL－1）人血浆样品后，再用空白基质稀释10 倍，精密移取稀释后的血浆样品100 μL，按照“2.1.3”项下方法制得。

2.2 方法学验证[12-14]

2.2.1 专属性考察 取“2.1.2”项下溶液，在“2.1.1”项条件下进样测定，记录色谱图（见图3）。PNSL、PNS 和内标PNSL-d8 的保留时间分别为2.05、1.65、2.00 min，空白血浆中的内源性物质不干扰药物和内标的测定，由图分析可知，基质成分不干扰目标物的测定，本试验方法选择性强。

图3 典型色谱图Fig 3 Typical chromatogram

2.2.2 标准曲线和定量限

① PNSL 标准曲线的回归方程y＝0.096x＋0.018（r2＝0.9992），线性范围为1.000 ～200.0 ng·mL－1，定量限为1.000 ng·mL－1，连续测定6 个定量限样本，准确度为106.90%，RSD为8.5%。

② PNS 标准曲线的回归方程y＝0.070x－0.057（r2＝0.9991），线性范围为0.4000 ～80.00 ng·mL－1，定量限为0.4000 ng·mL－1，连续测定6 个定量限质量浓度样本，计算准确度为102.4%，RSD为11%。

2.2.3 精密度和方法回收率 按照表1配制不同质量浓度的样品溶液，各平行6 份，按“2.1”项下方法测定，结果方法精密度与方法回收率良好，符合生物样品分析要求，见表1。

表1 泼尼松、泼尼松龙在人血浆中批间和批内精密度、准确度Tab 1 Precision and accuracy of prednisone and prednisolone in human plasma in inter and intra assay

2.2.4 稳定性 储备液（甲醇）在室温条件4.5 h 内稳定；工作液（50%甲醇水，V/V）在室温6 h 稳定；基质样品前处理6 h 稳定、冻融循环5 次稳定、自动进样器条件（约5℃）存放113 h 稳定、－80℃存放100 d 稳定，见表2。

2.2.5 基质效应 通过试验发现，内标归一化的基质效应符合要求。6 个不同来源的基质经内标归一化后的基质效应结果显示PNSL 的LQC（质控低浓度，3.000 ng·mL－1）、MQC（质控中浓度，15.00 ng·mL－1）和HQC（质控高浓度，150.0 ng·mL－1）样品的变异系数分别为1.42%、3.31%和1.15%。PNS 的LQC（1.200 ng·mL－1）、MQC（6.000 ng·mL－1）和HQC（60.00 ng·mL－1）样品的变异系数（CV）分别为4.20%、4.23%和3.23%。均小于15%，符合9012 法规生物样本检测的规定。

2.3 醋酸泼尼松片与泼尼松龙片药动学比较研究

该项试验方案经中南大学伦理委员会批准[批件号为2018 伦审第（21）号]，研究严格遵守世界医学会制定《赫尔辛基宣言》的有关伦理准则。本试验入组健康受试者16例，其中男性15例，女性1例，年龄在19 ～39 岁，体质量在45.0 ～83.7 kg，BMI 在（22.08±2.45）kg·m－2。所有受试者均充分了解试验方案和过程，并签署知情同意书。

2.3.1 给药与血样采集 受试者于试验前1日晚上入住病房，禁食10 h 以上。试验当日早上8：00 ～8：16 在研究人员的监督下，在坐姿下空腹单次口服对照制剂（R）泼尼松龙片1 片（5 mg）或受试制剂（T）醋酸泼尼松片1 片（5 mg），用240 mL 水送服，服药前后1 h 内禁止饮水（服药时的240 mL 水除外），服药4 h 内禁食。双周期试验，每周期内各8 人。分别于给药前（0 h）及给药后0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、1.75、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、24 h 采集静脉血各4 mL 置于预冷的肝素钠抗凝采血管中。全血样品采集后60 min 内离心（4℃、2000 g 离心10 min）备存。

表2 基质样品稳定性(n ＝6)Tab 2 Stability of matrix samples (n ＝6)

2.3.2 醋酸泼尼松片体内药动学参数 16 名健康受试者单次口服5 mg 醋酸泼尼松片与泼尼松龙片后，按照“2.3.1”项下方法采集血样，按“2.1”项下方法测定，主要药动学参数见表3和表4。

表3 空腹服用醋酸泼尼松片与泼尼松龙片的血浆中泼尼松平均药动学参数比较(n ＝16)Tab 3 Mean pharmacokinetic parameters of prednisone in plasma after administration of prednisone acetate tablets and prednisolone tablets on empty stomach (n ＝16)

表4 空腹服用醋酸泼尼松片与泼尼松龙片的血浆中泼尼松龙平均药动学参数比较 (n ＝16)Tab 4 Mean pharmacokinetic parameters of prednisolone in plasma after administration of prednisone acetate tablets and prednisolone tablets on empty stomach (n ＝16)

2.3.3 醋酸泼尼松片与泼尼松片体内药动学曲线

16 名健康受试者单次口服5 mg 醋酸泼尼松片或泼尼松龙片，平均血药浓度-时间曲线如图4。

图4 泼尼松龙和泼尼松平均血药浓度Fig 4 Mean blood concentration curve of prednisolone and prednisone

2.3.4 醋酸泼尼松片和泼尼松龙片体内药动学参数统计分析 醋酸泼尼松在体内经过代谢生成有药理作用的活性物质泼尼松龙，其中醋酸泼尼松的分子量为400.47，泼尼松龙的分子量为360.45。虽然醋酸泼尼松片和泼尼松龙片给药剂量均是5 mg，但其物质的量并不相同，即使醋酸泼尼松100%转化，也只相当于给药泼尼松龙4.5 mg。采用Winnonlin 8.1 统计学软件进行结果统计，并对结果进行分子量折算，结果见表5和表6。

表5 醋酸泼尼松片折算后血浆中泼尼松龙药动学参数的统计分析(n ＝16)Tab 5 Statistical analysis of prednisolone pharmacokinetics parameters in plasma after conversion of prednisone acetate tablets (n ＝16)

表6 醋酸泼尼松片折算后血浆中泼尼松药动学参数的统计分析(n ＝16)Tab 6 Statistical analysis of prednisone pharmacokinetics parameters in plasma after conversion of prednisone acetate tablets (n ＝16)

经过折算后泼尼松龙药动学参数Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的几何均值比值分别为96.17%、99.17%、99.66%，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信区间分 别 为87.73% ～105.42%、95.90% ～102.55%、96.19% ～103.27%；泼尼松药动学参数Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的几何均值比值分别为105.27%、101.65%、101.88%，Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信区间分别为98.88%～112.09%、97.54%～105.94%、97.90%～106.02%。

3 结论与讨论

3.1 血浆中泼尼松与泼尼松龙测定方法的建立

文献报道检测PNS、PNSL 浓度方法，主要有HPLC 法、LC-MS/MS 法、UPLC-MS/MS 和GC-MS 法等[15-19]。本研究使用的LC-MS/MS 法测定醋酸泼尼松片体内药动学数据，同时检测人血浆中的PNS 和PNSL 浓度，采用蛋白沉淀法，在甲醇-0.1%甲酸水做流动相条件下，梯度洗脱法可确保待测样品完全分离，耗时短，灵敏度高，可满足高通量同时测定PNS 及代谢产物PNSL 的要求。

3.2 醋酸泼尼松片与泼尼松龙片药动学比较研究

对醋酸泼尼松片与泼尼松龙片主要药动学参数Cmax、AUC0～t、AUC0～∞等进行统计学分析，经过折算后的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞的90%置信区间均在在可接受范围内（80%～120%）。这说明醋酸泼尼松片在消化道的降解是迅速而完整的，同时由于血浆中PNS 和PNSL 分别等效，说明醋酸泼尼松片与相同剂量（摩尔数）的泼尼松龙片具有生物等效性，醋酸泼尼松片完全可以替换泼尼松龙片。但是醋酸泼尼松吸收的详细情况特别是食物对醋酸泼尼松片药动学的影响有待进一步考证。