组织蛋白酶Z基因启动子部分位点在成人哮喘中的差异性甲基化表达及意义

张黎莎 杨贤苗 钱粉红

江苏大学附属医院呼吸科（江苏镇江212001）

支气管哮喘（简称哮喘），是一种由多种细胞及细胞因子参与的慢性炎症性疾病，在全球范围内发病率较高，目前已影响超过3亿人［1］。其发病与遗传及环境因素等表观遗传学因素密切相关［2-3］。DNA 甲基化作为表观遗传调控的重要内容，在转录因子调节、免疫相关通路调控、细胞分化等方面起重要作用［4］。目前研究多关注于DNA 启动子区甲基化对基因表达的影响，一般认为启动子区低甲基化上调基因表达，反之抑制基因表达，起到类似基因沉默的作用［5］。启动子的甲基化调控已被证实具有一定生物学价值，不仅与多种癌症的发生密切相关［6-7］，也与哮喘发病存在一定关联，已有学者发现多个与发病相关的低甲基化位点，且证明其与嗜酸性粒细胞活化、原始T 细胞数量减少等环节相关，亦有研究证明特定基因甲基化改变与交通尾气引起的哮喘密切相关［8-9］。

组织蛋白酶Z 基因（cathepsin Z gene，CTSZ）位于20 号染色体上一个频繁扩增区域［10］。其可通过影响单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等免疫细胞的迁移和吞噬、信号转导、细胞间通讯、增殖等功能在宿主免疫防御中起关键作用［11］。同时，CTSZ 基因被证实可调节基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase2，MMP2）及基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase9，MMP9）等在气道重塑中的关键基因及蛋白表达［12-13］。但CTSZ 基因及其甲基化水平与哮喘发病是否相关尚不明确。因此，本研究通过对哮喘患者鼻黏膜上皮细胞中CTSZ 启动子区两位点甲基化水平进行检测，分析其甲基化程度与患者哮喘控制情况和肺功能的是否存在关联，进而为哮喘的诊断提供新思路。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2017年9月至2020年6月于江苏大学附属医院呼吸内科门诊就诊的哮喘患者30 例，其中男20 例，女10 例，平均年龄（41.5 ±10.1）岁。纳入标准：（1）年龄18 ～65 岁，无吸烟史有自主行为能力；（2）有明确哮喘诊断病史，符合支气管哮喘防治指南［14］；（3）无过敏性鼻炎病史，无明显流涕、鼻塞等鼻部症状，近期无鼻腔给药史。排除标准：（1）有肿瘤、血液病、自身免疫病病史；（2）近1 个月内有上呼吸道感染病史；（3）有除哮喘外的其他呼吸道疾病病史等；（4）糖尿病，高血压等慢性疾病病史；（5）妊娠状态；（6）近1 个月内有糖皮质激素应用史。对照组选取30 例同期、同居住地、年龄相近、性别比例相近，无吸烟史及过敏性病史且与哮喘患者无直接血缘关系的健康体检者，其中男18 例，女12 例。平均年龄（44.8±8.3）岁。本研究通过江苏大学附属医院伦理委员会批准（批准号SWYXLL20200121-6）且全部受试者均已签署知情同意书。

1.2 分组标准由呼吸科医生按照哮喘控制测试问卷进行评分，根据评分结果将患者分为三组。25 分为控制组、20 ～24 分为部分控制组、19 分以下为未控制组。

1.3 样本采集及检测

1.3.1 鼻腔样本采集清洁鼻腔，少量生理盐水湿润鼻腔后以鼻刮匙于下鼻甲处反复轻刮5 ～10 次，将刮匙下端置入预先配置好的0.1%胶原酶溶液中，震荡数分钟，37 ℃水浴消化至无明显絮状物，12 000 r/min 离心5 min，PBS 清洗后再次离心置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.3.2 DNA 提取及甲基化水平检测冻存细胞放至室温后再次离心，按照DNA 提取试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）使用说明书提取DNA，检测其质量合格后使用重亚硫酸盐法处理DNA，以Methyl Target 测序法检测甲基化水平，测序实验委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.3.3 FEV1及FVC测定使用日本CHEST HI-101肺功能仪检测进行测定，由同一技术人员操作以保证操作符合欧洲呼吸学会标准［15］。患者测试前未吸入支气管扩张剂，重复测定3 次，误差＜5%，取最佳测量值，记录FEV1pred%及FEV1/FVC。

1.4 统计学方法所有数据采用SPSS 23.0 统计软件处理，正态分布计量资料以均数±标准差表示，以两独立样本t检验比较差异性。非正态分布计量资料以中位数及四分位数间距［M（P25，P75）］表示，以U 检验比较两组间差异性。DNA 甲基化水平与哮喘患者肺功能水平相关性采用Spearman相关分析。采用MedCalc 软件绘制受试者工作特征曲线（ROC 曲线），通过曲线下面积（AUC）、敏感性、特异性、约登指数等来判断甲基化水平用于哮喘诊断的效能。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 入组患者基本资料哮喘患者与对照组在年龄、性别、BMI等方面差异无统计学意义（P＞0.05），入组时肺功能显著低于正常对照组（P＜0.05）。

表1 哮喘组及健康对照组一般临床资料Tab.1 Characteristics of patients and healthy controls ±s

表1 哮喘组及健康对照组一般临床资料Tab.1 Characteristics of patients and healthy controls ±s

年龄（岁）女性［例（%）］BMI FEV1/FVC［M（P25，P75），%］FEV1pred［M（P25，P75），%］哮喘组（n=30）41.5±10.1 10（33.3）25.2±2.1 85.7（78.4，88.9）66.6（62.5，77.1）对照组（n=30）44.8±8.3 12（40.0）24.9±2.4 96.8（95.8，98.3）95.2（92.8，97.8）P 值0.164 0.595 0.652＜0.001＜0.001

2.2 两组间甲基化差异如图1 所示，哮喘患者CTSZ 启动子区域两位点均呈显著低甲基化，差异有统计学意义（P＜0.05）。

图1 甲基化水平定量分析Fig.1 Quantitative detection of methylation level

2.3 甲基化水平与哮喘控制情况两位点均在控制组中呈明显低甲基化表达，且甲基化水平随哮喘控制情况好转逐渐升高，差异有统计学意义（cg01623438 位 点P＜0.001，cg02744249 位 点P=0.001）。如图2。

图2 按控制情况分组后甲基化水平对比Fig.2 Differential methylation in different asthma control groups

2.4 肺功能相关性分析CTSZ启动子中两位点甲基化水平均与肺功能呈负相关，位点cg01623438中FEV1pred%及FEV1/FVC 相关系数分别为-0.706（P＜0.001）及-0.643（P＜0.001）；位点cg02744249中FEV1pred%及FEV1/FVC 相关系数分别为-0.692（P＜0.001）及-0.554（P=0.002）。见图3。

图3 肺功能相关性分析Fig.3 Correlation analysis of lung function

2.5 ROC曲线分析如图4，cg01623438用于辅助哮喘诊断时AUC 为0.806（95%CI：0.683 ～0.896），cut-off 值为0.882 2，敏感性为100%，特异性为50%，P＜0.000 1；cg02744249 用于辅助哮喘诊断时AUC 为0.749（95%CI：0.620 ～0.852），cut-off 值为≤0.600 3，敏感性为43.3%，特异性为100%，P=0.000 1。当进行两位点联合分析时，如图5 所示，AUC 为0.827（95%CI：0.707 ～0.912），cut-off值为≤0.460 3，敏感性为66.7%，特异性为83.3%，P＜0.000 1。

图4 两位点ROC 曲线分析Fig.4 ROC curve analysis of two sites

图5 两位点联合ROC 曲线分析Fig.5 ROC curve analysis of combined sites

3 讨论

哮喘作为常见的呼吸系统慢性疾病，目前诊断主要依赖于呼吸道症状及可变呼气气流受限的生理证据［16］。由于其症状表现较复杂，各地区中存在最高达70%的哮喘患者未被确诊［17］。近年来DNA 甲基化研究理论及技术快速发展，为哮喘诊治提供了新方向。目前已有较多基因及相关位点的甲基化被证明与哮喘发病相关。例如有研究对儿童哮喘病例进行全基因组甲基化测序分析，在哮喘儿童的不同组织样本共寻找到多个与哮喘发病相关联的甲基化位点及区域［18］。同时，甲基化改变也被证明与哮喘患者肺功能下降相关，并可将其用于肺功能不良和加速衰退期的临床鉴别［19］。此外，也有学者发现母体哮喘可影响特定基因甲基化水平，增加子代哮喘的发生率［20］。以上研究说明，DNA 甲基化密切参与环境和遗传这两个引起哮喘发生的重要环节，可能是哮喘诊断的潜在生物学标志物。

本研究发现CTSZ 基因启动子区域的两个甲基化位点cg01623438 及cg02744249 在哮喘患者中均呈现低甲基化表达，并且在按哮喘控制情况进行分组后发现未控制组甲基化水平最低，随控制情况改善而逐渐升高，提示CTSZ 基因在哮喘患者中存在差异性甲基化修饰，并且哮喘组甲基化程度受控制情况影响。哮喘患者目的位点甲基化水平与肺功能均呈负相关，结合其与控制情况关系可推测出在哮喘组中，甲基化水平降低指向不良预后，因此在临床工作中，可对患者一段时期治疗前后甲基化水平进行监测，有助于客观判断此治疗方案对患者的有效程度，以便于及时调整。ROC 曲线分析显示，两位点在单独用于哮喘诊断时差异均有统计学意义，cg01623438 敏感性较高，而cg02744249 特异性较高，当结合两位点后再次用于哮喘诊断时，总体敏感性及特异性均有改善，提示CTSZ 启动子甲基化水平在哮喘诊断中具有一定价值。因此，综上所述，笔者认为本研究中所涉及的CTSZ 启动子区域两个相关位点均与哮喘发病密切相关，且其可能是与肺功能改变相关的功能性位点，能较为客观地反应哮喘患者肺功能水平。在用于哮喘诊断、用药反应监测、肺功能监测等方面都有一定价值。

本研究是首次对CTSZ 基因启动子甲基化与哮喘的关联性进行分析，并且证明其在哮喘诊断及预后检测中均具有一定价值。并且由于已有大量研究证实鼻黏膜细胞与支气管上皮细胞在结构、功能、应激反应方面均有一定同一性［21-23］，因此本研究选取了更易被接受且快捷的鼻腔标本进行研究，为日后扩大研究数目提供可能。

但本研究尚不能说明甲基化改变是哮喘发生的原因还是结果，需要进一步的实验验证。此外，本研究纳入样本量较少，仍需继续扩大样本量验证。

综上，哮喘患者鼻腔细胞中CTSZ 启动子区域发生低甲基化，且其甲基化程度与肺功能改变和控制状态具有一定相关性，在用于哮喘诊断具有一定的敏感性及特异性，推测CTSZ 启动子区甲基化检测也许能够作为一种辅助诊断和治疗监测的生物标志物，但仍需要进一步具体研究其相关机制。