百合LoNHX2基因的克隆与表达分析

王安琪，薛晓霞，左 杨，张克中，崔金腾

(北京农学院 园林学院/城乡生态环境北京实验室/北京市乡村景观规划设计工程技术研究中心，北京 102206)

百合多数品种喜微酸性土壤，但北方地区的土壤偏碱，对百合根系造成持续盐碱胁迫，严重影响种球生长和产量。目前对百合盐胁迫的研究主要集中在生理生化特性研究，有报道0.8%～0.9%的NaCl可能是百合所承受的最大盐胁迫浓度[1]；刘艳妮等在1%盐浓度胁迫下对亚洲百合进行抗盐性突变体筛选，得到抗盐性诱变百合植株[2-3]；左志锐等比较2个百合的叶绿体和线粒体的超微结构，研究了品种'Sorbonne'和'Prato'在低盐处理下的结构变化[4]。

转运蛋白在营养物质摄取、代谢产物释放以及信号转导等广泛的细胞活动中起着重要的作用[5]。已有研究表明植物体内存在多个与Na+转运相关的蛋白,如液泡膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(vacuolar Na+/H+antiporter/exchanger,NHX)和细胞质膜上的Na+/H+逆向转运蛋白(Salt Overly Sensitive,SOS)[5]。液泡膜NHX蛋白主要行使Na+在液泡中区域化的功能，在提高植物耐盐性方面发挥了重要作用[6]。He等将拟南芥AtNHX1转入棉花后发现，转基因棉花能在高浓度NaCl条件下正常生长[7]。目前，NHX2基因研究较多，已在拟南芥[8]、羽衣甘蓝[9]、番茄[10]、小麦[11]、大叶藻[12]等多种植物中克隆出来，并做了进一步研究。另外，NHX基因在转基因植物拟南芥、番茄、茄果和水稻中也证实了耐盐性的改善[8]，但NHX基因在百合中尚少有相关研究。

百合为盐敏感植物，土壤盐碱化现象一直是困扰百合种植生产的重要问题，研究百合盐胁迫机理及其耐盐适应性，在理论和应用方面都具有重要意义。就此以OT型(东方百合与喇叭百合系间杂种)百合‘Robina’为材料，用200 mM NaCl对百合种球进行处理，分析百合LoNHX2基因在不同时间及不同部位的表达状况，为研究百合盐胁迫下的基因表达调控机理奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

采用OT型百合品种‘Robina’为材料，取若干种球种于北京农学院实验基地温室内，生长期间进行常规管理，待生长30 d后，用200 mM NaCl溶液对种植30 d的百合进行处理，分别取处理后的0、6 h、12 h、24 h的百合根系，同时，取常规培养的盛花期百合的根、茎、叶、花瓣、鳞茎，以上材料包上锡箔纸快速放入液氮中备用。

1.2 百合RNA的提取及cDNA的合成

使用植物 RNA 快速提取试剂盒(EASYspin Plus，艾德莱)提取根系样品的总RNA，用反转录试剂盒(TaKaRa)合成cDNA，最后用紫外核酸蛋白测定仪调节cDNA模板浓度至基本一致。采用1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性。

1.3 百合LoNHX2基因的克隆

根据课题组前期已有的百合转录组测序结果中的非重复序列基因unigene，查找LoNHX2基因，对LoNHX2基因的unigene进行序列比对发现5′端较完整，3′端有缺失。参照3-′RACE试剂盒(TaKaRa)操作步骤分别进行3′RACE扩增，设计3′RACE特异性引物3′GSP(GAAAAGTGGAGATTTGTCAGCA)和3′NGSP(AATCCCTATTTTCGTCGCTCAT)，并测序，通过DNAMAN软件拼接，获得LoNHX2基因全长cDNA。再根据最大开放阅读框设计上游引物LoNHX2-F(ATGGGTATCGATTTGGAGCCGG)和下游引物LoNHX2-R(TCATTCCCATTCAGGGACGCTT)，以cDNA为模板进行PCR扩增。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，用 DNA回收试剂盒(TaKaRa)进行切胶回收，用pMD19-T Vector连接转化并测序。

1.4 百合LoNHX2基因荧光定量分析

对200 mM NaCl溶液处理0、6 h、12 h、24 h后的百合根系的LoNHX2基因进行qRT-PCR，参照LoNHX2基因全长cDNA设计上游引物LoNHX2-YGF(TTTTCCGCAACTTTATGACC)和下游引物LoNHX2-YGR(CCTATCTCCCGTGAACCTAT)，内参上游引物Loactin-F(GCATCACACCTTCTACAACG)和内参下游引物Loactin-R(GAAGAGCATAACCCTCATAGA)。利用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(TaKaRa)在荧光定量PCR仪(Bio-Rad IQ5)上进行反应。反应体系为：SYBR Premix Ex Taq II(2×)12.5 μL；LoNHX2-YGF/Loactin-F 1 μL；LoNHX2-YGR/Loactin-R 1 μL；不同阶段的cDNA模板1 μL；dH2O 9.5 μL。反应程序为: 95 ℃预变性2 min; 95 ℃变性10 s, 58～60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 40个循环。采用Loactin作为内参基因，引物为Loactin-F和Loactin-R。每个样品生物学重复3次，技术重复3次。

1.5 百合LoNHX2基因的生物信息学分析

根据生物信息相关的数据库信息和在线程序对百合的LoNHX2基因所编码的氨基酸序列进行分析预测，根据预测结果分析其生物学意义。所使用的软件和程序为： MEGA5.12、Protparam以及DNAMAN软件；NCBI、ORFfinder、TMpred Sever、SignaIP 4.1 Server、Phytozome v12.1。

2 结果与分析

2.1 百合根系总RNA提取质量分析

对提取的百合根系总RNA进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带完整(图1)，可用于后续试验。

2.2 百合LoNHX2基因3’RACE克隆

在课题组前期进行的转录组测序结果中已有的LoNHX2 unigene序列的基础上，经过3’-RACE后，将目的条带进行切胶回收、pMD19-T Vector连接转化及菌液测序，得到1条501 bp条带(图2)。

2.3 百合LoNHX2基因全长cDNA的克隆结果

使用DNAMAN，将LoNHX2基因的unigene序列与3’RACE克隆序列进行拼接，得到全长cDNA序列。用在线程序ORF Finder找出LoNHX2基因的最大开放阅读框ORF。在ORF外设计引物，进行PCR。如图3和图4所示，得到一条1 608 bp片段，编码535个氨基酸。将测序结果与拼接结果在DNAMAN中比对，结果100%相似。

2.4 百合LoNHX2基因的生物信息学分析结果

通过ProtParam分析表明，百合LoNHX2基因编码的氨基酸序列分子式为C2751H4267N677O736S28，相对分子量为59 498.92，理论等电点(PI)为7.27，不稳定系数(Instability index II)为36.67，小于阈值，表明百合LoNHX2为稳定蛋白；总平均亲水性(GRAVY)为0.496，应该为脂溶性蛋白。LoNHX2由20种氨基酸组成，其中Leu(63，11.8%)、Ser(46，8.6%)、Phe(45，8.4%)、Val(44，8.2%)和Ile(40,7.5%)含量较丰富。所有氨基酸残基中带负电荷和正电荷的氨基酸残基数分别为41(Asp+Glu)、41(Arg+Lys)。

TMpredServer在线预测结果(图5)表明，该蛋白由内向外有11个跨膜螺旋，分布于氨基酸的21～41、50～66、75～97、107～128、147～166、219～238、271～289、303～324、342～359、384～400、417～436位置上；由外向内有12个跨膜螺旋，分布于氨基酸的21～41、51～68、76～99、111～131、148～165、170～191、218～238、268～286、303～321、338～359、382～400、416～435位置上，因此，该蛋白应是跨膜蛋白。SignaIP 4.1 Server分析表明，百合LoNHX2蛋白没有信号肽结构。LoNHX2蛋白二级结构在线预测表明，该蛋白中，α-螺旋(Alpha helix)和延伸链(Extended strand)所占比例最多，分别为为33.83%、31.03%，其次是无规则卷曲(Random coil)和β-转角(Beta turn)，分别占23.18%、11.96%。

2.5 百合LoNHX2蛋白序列同源性分析结果

利用DNAMAN将LoNHX2基因序列翻译为氨基酸序列，通过Phytozome v12.1数据库在其他物种中的NHX2蛋白序列，进行同源性比对结果(图6)表明，百合LoNHX2蛋白与其他物种的NHX2蛋白相似性较高，与拟南芥、水稻和玉米相似度分别为90.51%、89.42%、90.69%。

经NCBI中的CDD分析(图7)表明，百合LoNHX2蛋白具有液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白(NHX)家族的特征，有NhaP和Na-H exchanger特异性位点，且有典型的结构域b-cpa1、NhaP2、PRK05326。

从Phytozome v12.1数据库中，对双子叶植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)、苹果(Malusdomestica)、葡萄(Vitisvinifera)、千穗谷(Amaranthushypochondriacus)、耧斗菜(Aquilegiacoeruleav)、番茄(Solanumlycopersicum)、番木瓜(Caricapapaya)、毛果杨(Popolustrichocarpa)、甜橙(Citrussinensis)、野草莓(Fragariavesca)，对单子叶植物如玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasativa)、百合(Liliumhybrids)、小叶果蕉(Musaacuminata)，对石松纲植物江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)，孢子植物地钱(Marchantiapolymorpha)和绿藻纲植物团藻(Volvoxcarteri)、莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、杜氏盐藻(Dunaliellasalina)的全基因组进行BLAST比对，检索LoNHX2蛋白的同源序列，利用MEGA5.2邻接法进行系统进化树分析(图8)。根据进化树可知，百合(Liliumhybrids)与小叶果蕉(Musa acuminata)聚在一个分支，可信度为100%，与单子叶植物有较近的同源关系，体现了较近的亲缘关系。

2.6 百合LoNHX2基因的转录水平表达分析

在盛花期取百合‘Robina’的根、茎、叶、花瓣、鳞茎部位，分析LoNHX2基因在不同部位的表达量。由图9可知，盛花期百合的根、茎、叶、花瓣、鳞茎中均有LoNHX2基因的表达，且LoNHX2基因在花瓣中表达量最高，其次是叶片、茎、根，在鳞茎部位表达量最低。

在百合Robina种植30 d时，用200 mM NaCl对其进行盐胁迫，在处理0、6 h、12 h、24 h时，取百合根系并提取百合根系RNA，分析各处理时期LoNHX2基因的表达量变化。由图10可看出，在200 mM NaCl处理后，LoNHX2基因在根部的表达量呈先上升再下降趋势。处理12 h时表达量最高，处理0时表达量最低。说明在盐胁迫下，百合LoNHX2基因含量逐渐升高，而LoNHX2基因的积累可以降低植物细胞内Na+的浓度，防止植物受Na+毒害，由此提高百合的耐盐性。

3 结论与讨论

本研究根据转录组测序中已知的百合LoNHX2基因片段序列，设计3’端引物，通过巢式PCR扩增，克隆得到大小为501 bp的3’端序列。将克隆得到的3’端序列与已知序列拼接，得到LoNHX2基因全长cDNA序列，在最大开放阅读框ORF外设计全长特异性引物，经过PCR扩增得到大小为1 608 bp的全长序列，其中包括起始密码子ATG和终止密码子TGA，共编码525个氨基酸。用DNAMAN软件将其翻译为蛋白序列后发现，百合LoNHX2蛋白的分子式为C2751H4267N677O736S28，相对分子量为59 498.92，理论等电点(PI)为7.27，该蛋白为脂溶性蛋白、稳定蛋白。LoNHX2蛋白由20种氨基酸组成，蛋白由内向外有11个跨膜螺旋，由外向内有12个跨膜螺旋，无信号肽。二级结构中，α-螺旋(Alpha helix)和延伸链(Extended strand)所占比例最多。LoNHX2蛋白序列与拟南芥、水稻、玉米相似度分别为90.51%、89.42%、90.69%。

在獐毛中，用400 mM NaCl处理6 h后，根部AINHX1基因的的表达量相对于茎部明显升高，说明根部对盐胁迫更敏感。在处理6 h和12 h时，根部AINHX1基因的的表达量比对照CK分别上升了6倍和8倍，处理24 h后表达量降低[13]。本试验结果与这一致。本试验中，在200 mM NaCl处理后，LoNHX2基因在百合根部的表达量呈先上升再下降趋势。在处理0、3、6、12 h时表达量逐渐升高，处理24 h时表达量降低。此外，在大麦[14]、水稻[15]、灰绿狼尾草[16]中有相似的表达状况。说明LoNHX2基因在植物盐胁迫中有重要作用，可降低细胞质中Na+的浓度，从而降低高盐胁迫对植物细胞的伤害。

在百合不同部位中，LoNHX2基因在花瓣中表达量最高，其次是叶片、茎、根，表达量最低的是鳞茎，说明LoNHX2基因的表达具有普遍性，在不同部位表达差异量较大。这可能与在百合盛花期时采集样品有关，盛花期时花瓣中各细胞较为活跃、代谢旺盛，所以LoNHX2表达量较高，与此同时叶片、茎等组织部位均已处于成熟期，所以表达量较低。本研究克隆了百合LoNHX2基因序列，并分析了百合LoNHX2基因在不同时间及不同部位的表达状况，发现了LoNHX2基因的表达规律，为研究百合盐胁迫下的基因表达调控机理提供了理论参考。