外阴硬化性苔藓中医辨证分型与HLA-ABDRB1基因多态性的相关性研究

赵铭宇，吕 波，李 灼，石 晶，刘桂兰

(黑龙江省中医药科学院妇科·黑龙江 哈尔滨 150036)

外阴硬化性苔藓(VLS)的确切病因和发病机制尚不清楚，目前普遍认为该病为多因素致病，包括自身免疫、细胞增殖、感染因素、遗传和局部刺激等[1]。近年来国内外研究一致认为，VLS具有遗传易感性，且自身免疫因素可能是VLS发生发展的主要原因之一[2]。尽管其确切的发病机制仍存在争议，但其在外阴癌发病中具有潜在作用[3]。该病病变部位特殊，病因研究难以深入，对疾病的发生不能预防，给治疗带来了局限性[4]。本研究旨在探讨中国汉族妇女外阴硬化性苔藓患者中医辨证分型与HLA-ABDRB1基因多态性的相关性，为该病的病因学提供依据。

1 临床资料

1.1 一般资料

选自2005年1月—2013年12月于黑龙江省中医医院及哈尔滨医科大学附属第一医院、第二医院、黑龙江中医药大学附属第一医院就诊的病历资料完整的外阴硬化性苔藓(VLS)患者76 例；其中肝肾阴虚型40例(A组)，肝经湿热型36例(B组)。A组患者40例，21～30岁3例，31～40岁11 例，41～50岁19例，51～60岁7例，平均年龄(42.73±7.98)岁。B组36 例，21～30 岁 4 例，31～40 岁18 例，41～50 岁11 例，51～60 岁3 例，平均年龄(38.64±9.48)岁。另选取女性健康体检者62 人(选自合作单位哈医大一院)做为正常对照，21～30 岁 8 例，31～40 岁22 例，41～50 岁26 例，51～60 岁6 例，平均年龄(40.30±11.72)岁。各组年龄比较无统计学意义(P>0.05)。

1.2 病例纳入、排除标准 纳入标准：1)符合VLS的诊断标准[5]，中医辨证为肝肾阴虚型和肝经湿热型[6]；2)年龄20～60 周岁；3)患者本人签署知情同意书。排除标准：1)外阴上皮内瘤样病变，或病理检查确诊为原位癌、浸润癌等；2)伴有其他免疫相关性疾病及肿瘤、精神神经疾病者。

1.3 正常对照组纳入标准 1)知情同意者受试；2)健康体检者，排除VLS及其它相关免疫性疾病及肿瘤，排除精神神经疾病者。

2 方法

2.1 基因多态性关联检测

PCR-SSP方法。所有患者和健康对照组空腹取静脉血2.0～5.0 mL，EDTA抗凝，提取白细胞后置于-20 ℃保存，利用人类基因组DNA提取试剂盒Biovision提供)提取DNA，-70 ℃保存待用，使用盐析法提取全血基因组DNA。PCR扩增反应体积在50 uL，94 ℃变性5 min，然后94 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸40 s，5 个循环后改退火温度为58 ℃，共计34个循环。

2.2 统计学分析 HLA-ABDRB1基因频率通过计数测得，应用SPSS19.0统计软件，计数资料采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果见表1。

表1 各组HLA-ABDRB1基因多态性关联检测结果(例)

由表1可见：HLA-B*15等位基因在肝肾阴虚、肝经湿热两组中出现频率明显高于正常对照组，与正常组相比差异明显(P<0.01)。HLA-B*40等位基因在肝肾阴虚组明显低于正常对照组(P<0.01)；肝经湿热组与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)。HLA-DRB1*12等位基因在各病例组中出现频率均高，在肝肾阴虚组、肝经湿热组出现频率与对照组相比有极显著性差异(P<0.01)。

4 讨论

外阴硬化性苔藓(VLS)是常见的外阴皮肤疾病，发病率约为14.6/10万[5，7]，本病恶变率约为3%～4%[6，8]。既往有关VLS的研究中，均证实本病是与免疫遗传相关的疾病[7-10]。中医学将本病归于“阴痒”等前阴病中。

本课题组之前的研究在对231中国汉族女性外阴白色病变患者(其中外阴硬化性苔藓123例，外阴鳞状上皮增生92例)中医证侯分布特征的调查研究结果显示，肝肾阴虚型占据所调查VLS的56.10%(69例)，肝经湿热型占29.27%(36例)，而其它证型均不足总人数的5%。说明VLS的发病与肝肾阴虚有着极其密切的关系，并由此推测肝肾阴虚可能是VLS外阴皮肤萎缩、干涩不适的重要物质基础[9，11]。

肝肾阴虚型居于该病中医证型之首，说明肝肾在本病中占有重要的地位。先天禀赋不足，后天津液耗伤均可导致肝肾阴虚。肝肾阴虚阴肤失于濡养，可表现为干涩萎缩。所以VLS以肝肾阴虚型最为多见。而下焦局部环境潮湿，且湿郁化热，湿热下注；加之现代人多好食肥甘厚腻，生活安逸少劳，从而酿湿生热，导致湿热循经下注，发为阴部瘙痒，此为肝经湿热型最主要致病因素[10，12]。本研究选取与VLS发病最为相关的两种中医证型，即肝肾阴虚型VLS患者40例、肝经湿热型VLS患者36例，研究其与HLA-ABDRB1基因多态性的相关性。

HLA(human leukocyte antigen)受控于人类主要组织相容性复合体(MHC)的基因簇，定位于第6染色体短臂上，是目前所知人体最复杂的多态系统(具有显著的人种、民族和地域的差异)，是免疫遗传学、免疫生物学以及生物化学等学科重要研究领域[11-14]。

对于HLA 抗原与VLS发病的研究很多，其中认可较多的为HLA-DQ7，该基因在幼女VLS的阳性率为63.3%(19/30)[13，15]，据报道VLS患者中具有高表达的基因有HLA-A29、HLA-B40、HLA-B44、HLA-AW31、HLA-DQ7、HLA-DQ8、HLA-DQ9 等。Aslanian FM等[14，16]研究得出HLA-B*15等多个等位基因与硬化萎缩性苔藓相关。一项关于187例英国北欧女性外阴硬化性苔藓患者的研究显示，与对照组相比HLA-DRB1*12频率增加[15，17]。

本研究显示HLA-B*15、-DR*12等位基因与中国汉族妇女VLS的两个主要中医证型均具有相关性，是其易感基因。其与VLS的相关性与国外报道相吻合。HLA-B*40等位基因是肝肾阴虚型VLS的抗性基因，而肝经湿热型VLS病人的发病却与HLA-B*40无相关性。HLA-B*40等位基因在各组中的差异性异常表达体现了VLS不同中医辨证分型之间差异性的免疫遗传物质基础的存在。提示同一疾病中，HLA基因在不同地域、不同种族人群中表达的一致性，及不同中医辨证分型之间的显著差异性。

HLA分子自身极大的等位基因多态性可以作为多基因遗传性疾病的一个遗传标记，提示和寻找VLS的高危人群, 从而加强该病的早期预防，延缓疾病病变的发生、发展。由于病例数原因，下一步研究将扩大样本量，并进行多中心研究，重视人群低频率基因位点和单倍型的检测，综合考虑基因连锁不平衡等因素的影响。