应用实时荧光PCR快速检测血培养标本中的耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌*

李 媛，熊 樱，易佰城，陈国金，彭 莎，孙怀超，杨友华，何 超

1.四川省德阳市绵竹市人民医院检验科，四川德阳 618200；2.四川大学华西医院实验医学科，四川成都 610041

近年来，由于碳青霉烯类药物的广泛使用，肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物的耐药率逐渐升高，给临床治疗带来严峻挑战[1-3]。血流感染是一种严重的全身感染性疾病，患者住院时间长，病死率高，应尽快精准治疗以改善患者预后。以往耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)血流感染的实验室诊断主要依赖于血培养技术，该技术操作流程主要涉及样本孵育、仪器报阳后转种、菌株分离鉴定以及体外药敏试验，从血培养仪器报阳到出具药敏报告往往需要2～3 d，不能尽早指导临床治疗。因此，缩短CRKP的实验室检测时间，为CRKP相关血流感染提供早期快速的诊断依据，以改善患者临床结局，具有非常重要的临床价值。本研究旨在应用实时荧光PCR(RT-PCR)技术快速检测血培养标本中的肺炎克雷伯菌并进行耐药基因筛查，为CRKP相关血流感染提供早期诊治依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 标准菌株：肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705(碳青霉烯类耐药株)和肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706(碳青霉烯类敏感株)购自成都好映象科技有限公司。临床分离株：18株CRKP和30株非肺炎克雷伯菌(蜂房哈夫尼亚菌2株，植生拉乌尔菌3株，解鸟氨酸拉乌尔菌1株，产酸克雷伯菌2株，沙门菌属1株，丙型副伤寒沙门菌1株，洋葱伯克霍尔德菌1株，奇异变形杆菌2株，普通变形杆菌1株，铜绿假单胞菌4株，大肠埃希菌4株，阴沟肠杆菌2株，产气肠杆菌1株，摩根摩根菌1株，雷氏普罗威登斯菌1株，嗜麦芽窄食单胞菌2株，鲍曼不动杆菌1株)为绵竹市人民医院检验科(以下简称“本实验室”)于2018年3月至2019年7月从临床标本中分离的菌株。耐药基因阳性对照菌株DNA来自四川大学华西医院实验医学科，均已测序验证。

1.2仪器与试剂 细菌DNA提取试剂盒和荧光定量PCR反应试剂盒(TaKaRa宝生物)。SLAN-96P实时荧光定量PCR仪(上海宏石)，KDC-140HR高速冷冻离心机(中科中佳)，BACT/ALERT3D全自动血培养仪(法国生物梅里埃)等。

1.3方法

1.3.1血培养中肺炎克雷伯菌的快速检测

1.3.1.1细菌DNA的提取 挑取平板上纯菌落，用0.85%的NaCl溶液配制成0.5 MCF的菌悬液(相当于1.0×108cfu/mL含菌量)，再依次稀释成浓度为105、104、103、102、10、1、0.5和0.1 cfu/mL的菌悬液，取不同浓度菌悬液分别注入血培养瓶，摇匀后放入血培养仪，仪器报阳后，按照差速离心法[4](用无菌注射器抽取报阳的血培养瓶中标本4.0 mL，加入6.0 mL无菌生理盐水，混匀，180×g低速离心10 min；取3 mL上清液转至新的无菌管中，以14 170×g离心2 min；弃上清液，加入1.0 mL无菌生理盐水混匀，以14 170×g离心1 min；弃上清液，加入1.0 mL无菌生理盐水混匀，以14 170×g离心2 min；弃上清液，菌悬液沉淀用于DNA提取备用)将菌悬液浓缩，根据细菌DNA提取试剂盒说明书提取细菌DNA，置-20 ℃保存待用。

1.3.1.2引物合成 肺炎克雷伯菌Khe基因引物和探针序列如下[5]：正向引物KheF，5′-TGGGGATCCACCACGA-3′；反向引物KheR，5′-AGAGATAGCCGTTTATCCACAC-3′；探针KheTmp，5′-6FAM-GAGGAAGAGTTCATCTACGTGCTGGAGG-BH Q1-3′，由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.3.1.3Khe基因RT-PCR体系 在25 μL反应体系中，加入1×Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5 μL，正向和反向引物(0.2 μmol/L)各0.5 μL，探针(0.2 μmol/L)0.5 μL，DNA模板2 μL，灭菌水9 μL。肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705、ATCC BAA 1706为反应体系的内部质控。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，1个循环；94 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。退火阶段检测荧光(FAM通道)，随后使用上海宏石96P软件进行分析得到循环阈值(CT值)，以CT值≤35判定为阳性。

1.3.1.4灵敏度试验 转种复苏肺炎克雷伯菌ATCC BAA1705和ATCC BAA1706，用1.3.1.1方法提取细菌DNA，用1.3.1.3扩增体系进行荧光PCR检测，测定其最低检测限值。

1.3.1.5特异度试验 将本实验室收集的18株CRKP和30株非肺炎克雷伯菌进行转种复苏，按照1.3.1.1模拟血培养报阳，提取细菌DNA，按照1.3.1.3进行荧光PCR检测。

1.3.1.6重复性试验 按照1.3.1.4和1.3.1.5进行3次重复试验。

1.3.2耐药基因的快速筛查

1.3.2.1多重RT-PCR体系 取肺炎克雷伯菌标准菌株和耐药基因阳性对照菌株DNA，用多重PCR方法扩增KPC、NDM、VIM、IMP 4种耐药基因，引物序列见表1[6]。使用两个多重RT-PCR反应体系：一个用于检测KPC和NDM，另一个用于检测VIM和IMP。加样体系如下：Premix Ex Taq(1×)12.5 μL，引物和探针分别为0.5 μL，DNA模板2 μL，灭菌水6 μL(空白对照灭菌水加8 μL)。肺炎克雷伯菌16S rRNA作为每种反应体系的内部质控。扩增体系：95 ℃预变性30 s，1个循环；95 ℃变性10 s，60 ℃退火/延伸30 s，40个循环。在退火/延伸阶段采集荧光(FAM通道收集KPC/VIM数据，HEX通道收集NDM/IMP数据；ROX通道收集内部质控数据)，随后使用上海宏石96P软件进行分析得到CT值，以CT值≤35判定为阳性。

表1 用于碳青霉烯酶基因扩增的引物和探针序列

1.3.2.2CRKP临床分离株模拟标本的快速检测 使用1.3.1.1得到的18株CRKP临床分离株的血培养模拟标本DNA为模板，用1.3.2.1方法进行检测。

2 结 果

2.1RT-PCR检测血培养中肺炎克雷伯菌 采用1.3.1建立的RT-PCR体系对肺炎克雷伯菌标准株模拟血培养报阳标本进行扩增，得到的扩增曲线图见图1。

图1 RT-PCR检测血培养中肺炎克雷伯菌的曲线图

2.2灵敏度试验 除0.1 cfu/mL的菌液标本外，其余标本均检测到肺炎克雷伯菌，结果显示本研究的最低检测限为0.5 cfu/mL。

2.3特异度试验 除肺炎克雷伯菌菌株的模拟标本外，其他非肺炎克雷伯菌菌株的模拟标本均无典型扩增曲线，方法特异度为100%(48/48)。

2.4重复性试验 3次重复试验结果一致，证实该方法有较好的稳定性。

2.5RT-PCR快速筛查耐药基因 用1.3.2.1建立的RT-PCR方法检测肺炎克雷伯菌标准株和耐药基因阳性DNA得到的扩增曲线见图2和图3。

图2 RT-PCR检测血培养报阳标本中KPC阳性的扩增曲线图

图3 RT-PCR检测血培养报阳标本中NDM阳性的扩增曲线图

2.6CRKP临床分离株模拟标本的检测 18株CRKP检测出7株携带KPC酶基因[38.9%(7/18)]，9株携带NDM酶基因[50.0%(9/18)]，1株同时携带KPC酶基因和NDM酶基因[5.6%(1/18)]，1株未检测出任何耐药基因[5.6%(1/18)]。

3 讨 论

血流感染是常见感染性疾病，往往引起患者住院时间延长，住院费用增加，甚至导致不良预后的发生[7-8]。有研究表明，医院内感染中血流感染病死率为35.0%～60.0%，而在重症监护病房中的患者，血流感染病死率为31.5%～82.4%[9]。近年来，随着创伤性诊疗技术的开展、广谱抗菌药物的使用等[10-11]，血流感染的发病率较高，而高毒力和多重耐药的肺炎克雷伯菌血流感染更是引起了全球的广泛关注[12]。2018年全国细菌耐药监测报告显示，肺炎克雷伯菌在引起血流感染的病原菌中排名第二，仅次于大肠埃希菌[13]。并且，肺炎克雷伯菌临床分离株对碳青霉烯类药物的耐药率从2013年的4.9%上升到2018年的10.1%，总体呈现持续上升的趋势[13]。近年来，在美国、以色列、意大利和希腊等地区其耐药率也急剧上升，可高达68.0%[12]。因此，尽早进行病原菌的鉴定和耐药性分析，对该类细菌相关血流感染的临床诊治至关重要。

目前，血流感染的实验室检测主要依赖于血培养，菌株分离鉴定和体外药敏试验花费时间较长，不利于该类疾病的早期诊治。RT-PCR法作为核酸检测手段之一，具有较高的灵敏度、特异度和稳定性[14-15]。随着基层医院PCR实验室条件的逐步完备，基于该方法的病原学检测技术也适宜于基层医院推广使用。

Khe基因仅存在于肺炎克雷伯菌中，编码相对分子质量为19×103的蛋白，可能有溶血素活性，因此可作为鉴定肺炎克雷伯菌的特异性靶标[5]。本研究利用肺炎克雷伯菌特异性引物和探针建立的RT-PCR检测方法，对18株CRKP和30株非肺炎克雷伯菌的检测结果显示，特异度为100%，最低检测限为0.5 cfu/mL，并且该方法具有较好的稳定性。

已有报道指出，产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制[16]。实验室进行碳青霉烯酶的检测，可为抗菌药物的选择和精准治疗提供依据。美国临床实验室标准化协会(CLSI)文件推荐采用改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)检测碳青霉烯酶[17-18]，但该法需要过夜培养，检测时间相对较长。本研究利用RT-PCR技术在快速检测血培养标本中肺炎克雷伯菌的同时，进行常见碳青霉烯类耐药基因筛查，不仅可以确定菌株是否含有碳青霉烯酶，还可以对碳青霉烯酶的类型进行鉴别，并且缩短了试验周期，可为CRKP相关血流感染的早期精准治疗提供依据。

本研究分析了18株本实验室分离的CRKP菌株制备的血培养模拟标本，发现NDM酶基因的检出率和KPC酶基因的检出率分别为50.0%(9/18)和38.9%(7/18)，提示在绵竹市人民医院产NDM酶和KPC酶可能是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类药物的主要机制，但CRKP的遗传学来源有待进一步研究证实。有报道显示，产NDM-1型CRKP曾主要在印度次大陆播散[16]，但近年来产NDM-1型CRKP在中国多个地区被分离出，如浙江衢州[5.2%(4/76)][19]、南昌[2.4%(1/41)][20]等。但毕颖敏等[21]、付玉冰等[22]报道的上海和唐山地区产KPC酶是CRKP耐药最主要的机制。另外，本研究中尚有1株未检测出4种常见的碳青霉烯酶基因，尚待进一步研究其可能的耐药机制。

综上所述，本研究应用RT-PCR技术快速检测血培养中CRKP，该方法快速、灵敏、特异、重复性好，可为该类细菌相关血流感染的早期诊治提供依据，也可在基层医院进行推广应用。