高效液相色谱法测定脑心舒口服液中杂质5-羟甲基糠醛含量

李 玲，吴 琦，王婷婷

（江苏省连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222006）

脑心舒口服液主要成分为蜜环菌浓缩液、蜂王浆，辅料为蜂蜜、香精、苯甲酸钠，具有滋补强壮、镇静安神功效［1］。其质量标准收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂（第二十册）》［1］，标准中无杂质5-羟甲基糠醛（5-HMF）的检查项。蜂蜜作为矫味剂（用量为45%）添加到制剂中，蜂蜜中果糖和葡萄糖的总量不少于60%［2］。5-HMF 是由葡萄糖等单糖化合物在高温或弱酸等条件下脱水生成的醛类化合物，脑心舒口服液在制备过程包括将蜂蜜在90 ～100 ℃下加热炼制环节［1］，故极易降解出杂质5-HMF。5-HMF 为第2 类基因毒性杂质［3］，对人体有致敏性、致癌性、神经毒性、基因毒性等副作用［3-6］。杂质尤其是基因毒性杂质作为影响药品安全性的关键因素，目前已成为药品评价和研究的重点［7］。本试验中建立了测定脑心舒口服液中5-HMF 含量的高效液相色谱法，旨在为制剂的质量控制和质量标准提高提供参考。现报道如下。

1.5-羟甲基糠醛A. 对照品溶液 B. 供试品溶液 C. 阴性对照品溶液图1 高效液相色谱图1.5 -hydroxymethylfurfuralA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695 型高效液相色谱仪，包括Empower 软件（美国Waters 公司）；KH-700DE 型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；BP211D 型十万分之一电子天平（德国Sartorius 公司）。

1.2 试药

5 -HMF 对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111626-201912，含量为99.2%）；脑心舒口服液（市售中药制剂）；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0 ～13 min 时10%A，13 ～14 min 时10%A→80%A，14 ～20 min 时80%A，20 ～21 min 时80%A→10%A，21～30min 时10%A）；流速：1.0mL／min；检测波长：284nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。

2.2 溶液制备

对照品溶液：取5-HMF 对照品适量，精密称定，加甲醇-水（1 ∶1，V／ V）制成每1 mL 含5-HMF 102.2 μg的对照品贮备液；精密吸取2 mL，置20 mL 容量瓶中，用甲醇-水（1 ∶1，V／ V）定容，摇匀，制成每1 mL 含5-HMF 10.22 μg 的对照品溶液。

供试品溶液：精密量取样品1 mL，置20 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1 ∶1，V ／ V）超声（功率200 W，频率40 kHz）处理，并定容，摇匀，滤过，即得。

阴性对照品溶液：按脑心舒口服液处方和工艺制备不含蜂蜜的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

专属性试验：取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各适量，按2.1 项下色谱条件进样测定。结果理论板数按5-HMF 峰计应不低于3 000，阴性对照品溶液色谱中，在与5-HMF 对照品溶液色谱相应保留时间处无干扰峰，表明专属性良好。详见图1。

线性关系考察：分别精密量取2.2 项下5-HMF 对照 品 贮 备 液0.04，0.20，1.00，2.00，4.00，10.00，15.00 mL，分别置20 mL 容量瓶中，加甲醇-水（1 ∶1，V／ V）定容，摇匀，制成系列对照品溶液。精密量取20 μL，按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以5-HMF 质量浓度（μg／mL）为横坐标、峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y＝142 764X-32 163，r＝0.999 7（n＝7）。结 果 表 明，5-HMF 质 量 浓 度 在0.204 ～76.65 μg／mL 范围内与峰面积线性关系良好。

定量限、检测限考察：将对照品溶液逐级稀释，按2.1 项下色谱条件进样测定，以信噪比（S／ N）10 ∶1，3 ∶1分别计算定量限和检测限。结果定量限和检测限分别为0.21，0.07 μg／mL。

精密度试验：取2.2 项下对照品溶液，按2.1 项下色谱条件连续进样测定6 次，记录峰面积。结果5-HMF 峰面积的RSD为0.37%（n ＝6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为200208）适量，按2.2 项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，6，12，24 h 时按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果5-HMF 峰面积的RSD为1.16%（n ＝6），表明供试品溶液在室温下24 h 内稳定。

重复性试验：取样品（批号为200208）适量，平行6 份，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下色谱条件进样分析，记录峰面积，并计算含量。结果5-HMF 峰面积的RSD为1.75%（n ＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量样品（批号为200208）0.5 mL，共9 份，分别加入低、中、高质量浓度对照品溶液，按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算回收率。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n ＝9）Tab.1 Results of the recovery tests（n ＝9）

2.4 样品含量测定

取12 批样品各适量，分别按2.2 项下方法制备供试品溶液，再按2.1 项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算样品中5-HMF 的含量。结果见表2。

表2 样品信息及5 -HMF 含量测定结果（mg／mL，n ＝12）Tab.2 The information of the samples and the results of content determination of 5 -HMF in the samples（mg／mL，n ＝12）

3 讨论

预试验中，对甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.01%磷酸溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等流动相体系进行对比考察，并对不同梯度洗脱比例进行摸索，最终确定采用甲醇-0.1%磷酸溶液为流动相，进行梯度洗脱。在此色谱条件下，5-HMF 峰形对称，理论板数最佳，并能与相邻成分峰达到完全分离。

耐用性试验中适当改变色谱条件，如流动相中磷酸溶液体积分数（0.08% ，0.10% ，0.12% ）、流速（0.9，1.0，1.1 mL／min）、柱温（25，30，35 ℃），结果各考察因素在耐用性范围内变动时，供试品中5-HMF 含量测定结果基本一致，表明流动相、流速和柱温在一定限度内变化时，本方法能满足试验要求，耐用性较好。

试验中收集了12 批市售脑心舒口服液（10 个不同生产企业），含量测定结果表明，12 批样品中均检出5-HMF，且各批次样品间差异较大，最高质量浓度与最低质量浓度相差约200 倍，可见市售脑心舒口服液质量参差不齐。2015 年版《中国药典（一部）》规定蜂蜜中5-HMF含量不得过0.004%［2］，按脑心舒口服液的处方工艺（蜂蜜占45%），理论计算制剂中5-HMF 含量最高为0.018 mg／mL，所检测样品中仅1 批的5-HMF 含量低于0.018 mg／mL。可见，脑心舒口服液中5-HMF 的来源很可能是制剂在处方制备过程中蜂蜜加热炼制（90 ～100 ℃）［1］降解产生，有的厂家的5-HMF 含量尤其高，也可能为使用了劣质蜂蜜作为辅料或蜂蜜加热炼制时间过长导致。

脑心舒口服液的用量为1 次10 mL，1 日2 次，而脑心舒口服液中5-HMF 的质量浓度范围为0.006 1 ～1.247 mg ／ mL，则 最 大 日 暴 露 量 为24.94 mg，远 超5 -HMF 作为第2 类基因毒性杂质限度的要求［3］。因毒性杂质在低浓度时即可造成人体遗传物质的损伤，进而导致基因突变，甚至促使肿瘤发生［7］。蜂蜜虽是脑心舒口服液中的辅料，但辅料也是影响药品安全性的重要因素，国内外越来越重视辅料的研究，辅料中降解杂质的毒副作用也应引起足够重视。因此建议，生产厂家优化处方制备工艺，改善样品存储温度或选用更优质的辅料，以降低样品中5-HMF 的含量。同时，对5-HMF 进行质量控制，并纳入脑心舒口服液的质量标准中，以提高产品的质量和用药安全。