芒果酸奶发酵及后熟过程中乳酸菌素的产生及其抑菌作用

吴小艳,刘文星,刘忠义*,李希宇,付满,李汀

1(北部湾大学 食品工程学院,广西 钦州,535011) 2(湘潭大学 化工学院,湖南 湘潭,411105)

酸奶中含有大量活性乳酸菌,在酸奶的贮运和分销过程中仍会进行新陈代谢,缓慢产酸并产生风味物质,因而需要保证所有环节处于低温环境,以抑制有害微生物的生长繁殖和延缓产酸的速度[1-2],从而保证酸奶的感官和安全品质,延长其保质期。但很多时候因成本高昂难以实现全程冷链,而采用热处理杀菌方法将对酸奶风味产生不良影响,乳酸菌素的出现给上述问题指出了解决方向与途径[1-2]。

乳酸菌素是由乳酸菌发酵产生的一类抗菌素[3]。国内关于乳酸菌素的相关研究起步于1980年代,主要是以乳酸链球菌素的研究为主[4-5]。由于乳酸菌素具有安全性高等优点,在抑菌、防腐、保鲜等方面成为研究热点,被公认为安全的纯天然微生物防腐剂和抗菌剂[5],广泛应用于各类食品的防腐保鲜贮藏[6-7]和医药领域[8]。除了单独使用,乳酸菌素还可与纳他霉素等其他食品防腐剂联合使用[9-10]。作为乳酸菌的次生代谢产物,乳酸菌素的产生受到菌株生长、pH、温度等多种因素的影响[11-14]。然而,在酸奶正常发酵条件下,作为发酵剂的乳酸菌是否会在酸奶生产及其贮运过程中产生乳酸菌素仍未可知。

本研究以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为对象菌,通过逐步排除实验,对芒果酸奶中可能的抑菌物质进行了研究,确认了芒果酸奶发酵、后熟及贮藏过程中所有的抑菌物质,为芒果酸奶的抑菌和品质保证提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸奶发酵剂(嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌),北京川秀国际贸易有限公司；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus),赛莫尔科学实验用品有限公司；胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶,食品级,河南万邦实业有限公司；其他均为生化试剂或者分析纯。

1.2 仪器与设备

YB游标卡尺,安冠龙仪器有限公司；SCIENTZ-18 N牛津杯,宁波新芝生物科技股份有限公司；SPX-250B-D振荡培养箱,上海博远实业有限公司；BAS224S电子天平,赛多利斯科技有限公司；DL-6M冷冻离心机,湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 发酵液的制备

酸奶的制作：将水和奶粉按质量比1∶8混合溶解,8%(复原乳质量分数,下同)的白砂糖和适量稳定剂混合后加热溶解,待稳定剂完全溶解后再加入复原乳中,在60 MPa下均质10 min后倒入圆底烧瓶中,95 ℃灭菌5 min[15],倒入烧杯冷却至45 ℃左右,加入5%的芒果酱,添加1%酸奶发酵剂搅拌均匀后密封,43 ℃下发酵10 h后取出,待冷却至室温后,在1 000 r/min下搅拌5 min,密封后置于4 ℃冰箱中后熟24 h,发酵完成[16]。然后继续置于4 ℃冰箱中后熟72 h。不添加芒果酱及稳定剂的酸奶做为空白对照。

酸奶发酵液的准备：将后熟0、12、24、36、48、60和72 h的芒果酸奶,在超净工作台中分别取30 mL置于50 mL离心管中,并于冷冻离心机中在4 ℃,6 000 r/min下离心30 min,收集上清液,置于4 ℃冰箱中冷藏备用[17]。

1.3.2 指示菌的培养

将枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌分别从菌种斜面上接种到营养琼脂培养基斜面中,37 ℃恒温培养24 h。用无菌生理盐水将斜面细胞洗下制成菌悬液,利用血球计数板计数,将菌悬液稀释至浓度106CFU/mL[18-19],备用。在300 mL营养琼脂培养基(60 ℃左右)中添加3 mL稀释的指示菌菌悬液摇匀,制成指示菌培养基。

1.3.3 酸奶抑菌作用的测定

先在灭菌平皿中注入冷却至50～60 ℃左右的2.0%的素琼脂,待凝固后,用无菌镊子取4个直径为8 mm的无菌牛津杯置于其中,再倒入含有指示菌的培养基,凝固后用镊子拔去牛津杯。在牛津杯孔中加入200 μL前述酸奶发酵上清液,做好标记并迅速放入4 ℃冰箱中扩散4 h,再放入恒温培养箱中培养,观察是否有抑菌圈,并测量其直径的大小。

1.3.4 酸抑菌作用排除实验

酸奶发酵过程产生乳酸等酸性物质会对一些细菌有抑菌作用,为排除酸及其他酸性末端产物的干扰[20],用1 mol/L NaOH溶液调整无细胞发酵液的pH值为6.0(对指示菌无抑制作用)[17]，按1.3.3小节的方法完成实验。

1.3.5 H2O2抑菌作用排除实验

乳酸菌代谢过程会产生H2O2等强氧化性物质,对一些细菌也有抑制作用[21]。为进一步排除干扰,取6.0 mL酸奶上清液,调节pH至7.0,加入60 mg过氧化氢酶,轻轻摇晃至溶解,37 ℃保温2 h,再将pH调至6.0,用双层牛津杯法进行抑菌实验。

1.3.6 蛋白酶验证实验

取3份6.0 mL酸奶上清液,调节pH值为胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶作用的最适pH值(7.4、6.0 和2.0),分别于3份酸奶上清液中加入6.0 mg不同酶液,在适宜温度下(分别为37、55和37 ℃)反应4 h后调回原始pH值,测定酶处理后与处理前的抑菌活性[22],以确定酸奶排除过氧化物作用后,剩余的抑菌物质是否为乳酸菌素。

1.4 数据处理

所有实验均进行5次平行实验,数据采用软件SPSS 17.0的One-way ANOVA程序进行均值计算与方差分析,P<0.05表示具有显著性差异,数值以平均值±标准差表示,采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与讨论

2.1 水果酸奶的抑菌效果

后熟0、12、24、36、48、60和72 h的不同酸奶样品上清液对指示菌的抑菌效果分别见表1、表2和表3。所有酸奶样品对3种指示菌都有抑制作用,其中,对枯草芽孢杆菌的抑菌效果尤为显著,而对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果则相对较弱(P<0.05),随后熟时间延长,抑菌效果先增强后趋于平缓。这可能是因为酸奶pH较低,随着后熟时间的延长,pH值不断降低,从而抑制杂菌的生长,这也是酸奶被称作最安全食品之一的主要原因。有研究表明当pH降到4.0左右时,在4 ℃低温下,酸奶中大肠杆菌等致病菌基本不能存活[23]。

2.2 酸对芒果酸奶抑菌效果的影响

分别取后熟0、12、24、36、48、60和72 h添加复配稳定剂的芒果酸奶上清液,并将其pH调整至6.0进行抑菌实验,对指示菌的抑菌效果如图1所示。

表1 不同酸奶对枯草芽孢杆菌的抑制作用Table 1 Inhibition of different yogurt on B.subtilis

表2 不同酸奶对大肠杆菌的抑制作用Table 2 Inhibition of different yogurt on E.coli

表3 不同酸奶对金黄色葡萄球菌的抑制作用Table 3 Inhibition of different yogurt on S.aureus

图1 芒果酸奶中有机酸的抑菌效果Fig.1 Bacteriostatic effect of organic acids in mango yogurt注：点线图代表原液抑菌效果,柱形图代表酸排除后抑菌效果

排除了酸的抑制作用后,芒果酸奶仍对3种指示菌有抑制作用,且其抑菌规律与酸共同作用时大致相似。其中,对枯草芽孢杆菌抑制作用最为显著,大肠杆菌次之,对金黄色葡萄球菌抑制作用尤为微弱(P<0.05)。随着后熟时间的延长,对3种菌的抑制效果都呈显著增强趋势,但没有出现后期平缓的趋势。这说明芒果酸奶中除了酸起主要抑制作用,其他物质也有一定的抑菌作用,且这些物质随着后熟时间的延长,其含量不断提高。CAI等[20]研究发现酸类物质对一些细菌的生长有抑制作用,本实验所用混合乳酸菌种在生长代谢过程中也会不断产生乳酸等酸类物质,从而对指示菌产生抑制作用,同时随着芒果酸奶后熟时间的延长,乳酸菌不断生长繁殖并产生大量次生代谢产物,酸奶的酸度不断增大,pH不断降低,抑菌效果增强。

与未排除酸作用的酸奶相比,芒果酸奶的抑菌作用减弱了很多(P<0.05),说明芒果酸奶中有机酸起主要抑菌作用,尤其是前期。但随着后熟时间越来越长,有机酸的抑菌作用开始趋于平缓,这时,芒果酸奶中其他物质开始逐步提高酸奶的抑菌作用。

2.3 过氧化氢对水果酸奶抑菌效果的影响

分别取后熟0、12、24、36、48、60和72 h的添加了复配稳定剂的芒果酸奶上清液,经过氧化氢酶处理并将其pH调至6.0后的抑菌结果如图2所示。在排除酸作用的基础上,进一步排除过氧化物作用,后熟时间为0和12 h的芒果酸奶对指示菌皆无抑制作用,而后熟24～72 h的芒果酸奶抑菌效果规律与只排除酸作用时结果一致,芒果酸奶仍对指示菌有抑制作用,对枯草芽孢杆菌抑制作用最显著,大肠杆菌次之,对金黄色葡萄球菌抑制作用最为微弱。随后熟时间延长,对3种菌的抑制效果都呈显著增强趋势,在排除酸作用的基础上,抑菌作用进一步减弱,但仍有效果。有研究表明过氧化氢在合适条件下可以产生活性单氧,有极强的生物致死作用[24],酸奶发酵过程中,乳酸菌进行次生代谢也会产生少量的过氧化氢产物,从而对指示菌产生一定的抑制作用,但对比图1和图2可知,酸奶中产生的过氧化氢的抑菌效果微弱,这与酸奶中过氧化氢浓度较低及自身pH较低有关。由图2可知，酸奶中除了酸、过氧化氢,还存在其他抑菌物质,且该类抑菌物质是在水果酸奶后熟超过12 h才开始产生的。

图2 芒果酸奶中过氧化物和乳酸菌素的抑菌效果Fig.2 Bacteriostatic effect of peroxide and lactobacillin in mango yogurt注：点线图代表原液抑菌效果,柱形图代表排除酸+过氧化氢抑菌效果

2.4 蛋白酶处理对抑菌作用的影响

后熟0、12、24、36、48、60和72 h并添加了复配稳定剂的芒果酸奶上清液,分别用胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶处理后的抑菌实验结果见表4、表5和表6。经3种蛋白酶处理后,后熟0和12 h的芒果酸奶抑菌作用没有变化,后熟24、36、48、60和72 h的酸奶,随着后熟时间的延长,抑菌作用下降趋势逐渐明显。研究结果与前人研究结果[17, 25-28]有一定的相似性,这说明混合乳酸菌在芒果酸奶发酵和贮藏过程中产生了乳酸菌素,且是在后熟12 h后(生长总时间22 h)才产生抑菌效果。表4、表5和表6对比可知,乳酸菌素对胰蛋白酶敏感度较高,胃蛋白酶和木瓜蛋白酶次之。赵鸭美[17]也发现不同类型的乳酸菌素对不同蛋白酶的敏感程度不同。

本实验结果表明,芒果酸奶中乳酸等有机酸与乳酸菌素以及过氧化氢起协同抑菌作用,其抑菌作用具有累加的效果;这和前人的研究结果基本一致[17,25,27-28]。也有研究表明,乳酸菌素和纳他霉素[9]、有机酸盐[29]也具有累加的协同抑菌作用。

表4 胰蛋白酶对芒果酸奶抑菌效果的影响Table 4 Effect of papain on the bacteriostasis of mango yogurt

表5 胃蛋白酶对芒果酸奶抑菌效果的影响Table 5 Effect of pepsin on the bacteriostasis of mango yogurt

表6 木瓜蛋白酶对芒果酸奶抑菌效果的影响Table 6 Effect of trypsin on the bacteriostasis of mango yogurt

3 结论

酸奶及芒果酸奶对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌都有较强的抑制作用,添加复配稳定剂对酸奶的抑制作用没有显著性影响,而添加芒果酱则能在一定程度上增强酸奶的抑菌效果。

芒果酸奶的抑菌物质主要来源于发酵过程中乳酸菌产生的乳酸等有机酸、过氧化氢以及乳酸菌素,但乳酸菌素的抑菌作用是在芒果酸奶后熟12 h才开始体现出来。芒果酸奶发酵过程产生的乳酸菌素对胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶敏感。

芒果酸奶的抑菌作用是乳酸菌素、有机酸及过氧化氢共同作用的结果,这些物质的抑菌效果明显具有累加效应,且随着酸奶后熟时间的延长,抑菌物质浓度不断升高,抑菌效果不断增强。