硫酸改性后的聚醚醚酮对小鼠骨髓巨噬细胞生存活性的影响

2021-04-27杨妍吴高义王菁朱国雄

实用口腔医学杂志 2021年2期

杨妍吴高义王菁朱国雄

目前，口腔种植材料多选择钛、钛合金等，其具有良好的生物相容性和较高的机械强度[1]。但金属的弹性模量远高于人体骨组织，种植体植入骨内后产生“应力屏障”效应[2]。此外，金属材料还具有潜在的离子释放效应。释放的金属离子可加重种植位点的局部炎症，影响组织形成骨结合[3]。

近期研究发现线性芳香族、半结晶高分子聚合物聚醚醚酮(polyetheretherketone, PEEK)，成为较金属更优秀的种植材料。PEEK是一种热塑性聚合物，耐腐蚀、耐高温，弹性模量为3～4 GPa，比起钛合金更接近皮质骨(18 GPa)，并且有较好的生物相容性[4]。此外，PEEK还在接受CT、MRI扫描时不出现伪影，较容易监控骨生长及愈合过程。但它较差的骨传导和疏水性对临床上广泛应用造成了困难[5]。面对这一问题，常通过表面改性来解决[6]，材料表面改性是提高材料生物性能和亲水性有效的途径。亲水性增加会改变蛋白吸附模式，引起轻微的炎症反应，更有利于炎症的控制和种植后组织修复[7]。

在口腔种植愈合过程中，快速建立稳固的骨结合、保持种植体周围骨水平是口腔种植成功的关键。种植愈合过程中，机体经历了血肿期、炎症期、增殖期、重建期等几个阶段。其中免疫炎症反应的结果决定了种植体骨整合的形成[8]。炎症细胞可释放多种调节靶细胞功能的分子，而巨噬细胞作用尤为明显。研究表明，生物材料表面诱导的巨噬细胞分泌物不仅影响间充质干细胞的成骨分化，还影响骨祖细胞的成骨活性[9]。故本次实验运用硫酸改性材料，构建了一个表面具有2D孔隙结构的PEEK，提高了亲水性并检测改性后材料对巨噬细胞生存活性的影响。

1 材料与方法

1.1 制备PEEK样本

实验中所有使用的PEEK材料(Thornton Cleveleys, United Kingdom)均采用压铸加工工艺，并为医学级。将材料加工成不同的尺寸，正方形样本(10 mm×10 mm×1 mm)用于材料表面表征测试，圆片样本(直径14 mm，厚1 mm)用于细胞培养。所有样品使用SiC砂纸进行双面抛光处理。并在丙酮、乙醇和超纯净水中进行超声波清洗，干燥后备用。

1.2 样品分组

A、对照组(N)处理如1.1所述； B、3D网状结构组(3D)：为获得均匀的多孔结构，材料在搅拌过程中一直使用磁力搅拌器。在室温下使用浓硫酸搅拌30 s，后浸在0 ℃去离子水中搅拌10 min，最终浸泡在超纯水中48 h； C、2D孔隙结构组(2D)：样品在室温下使用浓硫酸搅拌30 s，后放入63.5%硫酸中搅拌10 min，再将样品浸在0 ℃去离子水中搅拌10 min，最终浸泡在超纯水中48 h。

1.3 材料表面性能

运用场发射扫描电子显微镜(FE-SEM, Hitachi S-4800, 日本)检测各组材料表面形貌。使用傅里叶红外光谱仪(Bruker, Vertex70，德国)对材料表面官能团进行检测。采用接触角测量(SL200B型自动接触角测量仪，上海梭伦信息科技有限公司)对样品的表面润湿性进行评价。每个实验重复3 遍。

1.4 体外实验

1.4.1 巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDMs)细胞培养 5～8 周C57小鼠(第四军医大学动物实验中心)脱颈处死后，75%乙醇浸泡5 min，无菌操作台分离胫骨和股骨，浸泡于含5%双抗的PBS中去净骨膜，再转移至1%双抗PBS培养皿中切去两端骨骺，用2.5 mL注射器抽取适量PBS冲洗骨髓直至发白为止。收集细胞悬液1 200 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清，细胞沉淀加入1 mL红细胞裂解液重悬，静置5 min后加入2 mL PBS，1 200 r/min、4 ℃离心5 min，弃上清，细胞沉淀用7 mL含有15%血清的DMEM培养基重悬，接种细胞培养皿内，在37 ℃，5% CO2环境下孵育3 h。收集培养上清，细胞计数，稀释细胞，加入40 ng/mL的巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)，置入培养箱培养3 d，半量换液再次加入40 ng/mL的M-CSF，培养3 d。

1.4.2 流式细胞仪鉴定BMDMs 胰酶消化细胞，PBS洗涤。制备单细胞悬液，细胞密度约1×106个细胞，每份取100 μL单细胞悬液。细胞悬液经1 mL PBS重悬，加1 mL流式buffer(含2% FCS、0.05% NaN3的PBS液)4 ℃ 1 240 r/min离心5 min，弃上清。加入0.5 μL的F4/80 FITC和CD11b APC和20 μL流式buffer。 4 ℃下避光孵育30 min后加入300 μL流式buffer重悬成单细胞悬液上机检测。

1.4.3 流式细胞仪检测BMDMs生存活性 3 组PEEK样品，每组4 片高压灭菌后放于24 孔板内，BMDMs细胞以2.5×105cells/cm2浓度接种于材料表面，空白对照组细胞直接培养在24 孔版的孔内。 24 h后，胰酶常规消化，收集细胞1 200 r/min离心5 min，弃上清。流式buffer重悬，进行细胞计数，每组取1×106个细胞收集于流式管中，1 200 r/min离心5 min，倒去弃液，每管加入300 μL 流式buffer 1 μL PI染液，4 ℃避光孵育30 min后进行流式检测。

整个实验重复3 遍。

1.5 统计分析

2 结果

2.1 电镜下材料表面形貌

FE-SEM观察各组试件表面形貌，如图1所示，N组对照组，在镜下可见材料表面光滑，仅存在有均匀平行的抛光划痕。3D组低倍镜(×1 000)下可观察到致密均匀的多孔状结构，高倍镜(×10 000)下可见3D网状结构，彼此套叠，孔隙直径在1.2～2 μm之间。

图1 各组材料表面微观结构(SEM)

2D组在低倍镜(×1 000)下观察可见均匀孔洞状结构，高倍镜(×10 000)可见到孔状直径在0.5～1 μm之间。由此可见通过控制PEEK与硫酸的反应条件可以改变材料表面最后形成的结构。

2.2 红外光谱

图2为3 个样品的红外观测结果。 3 组样品在1 188、1 158 cm-1吸收峰处可见C-O-C伸缩振动，在1 600 cm-1吸收峰处可见PEEK所含的芳环(C=C)。 3 组样品红外数据结构基本类似，当仍有不同。3D组和2D组在1 050 cm-1吸收峰处可见S=O对称拉伸，但N组并未存在。且2D组吸收峰幅度更明显，可以认为2D组S=O含量更高。此外3D组和2D在3 393 cm-1吸收峰处可见磺酸羟基-O-H，但N组未见，且2D组吸收峰幅度大于3D组。所以可认为PEEK与硫酸反应，引入了磺酸基团，且2D组磺酸基团含量高于3D组。

2.3 水接触角

研究表明水接触角越小，材料亲水性越好。N组水接触角为72.90°，2D组为63.22°，孔洞状表面最为亲水，3D组为84.95°, 网状结构表面最为疏水(图3)。

2.4 BMDMs纯度鉴定

BMDM细胞纯度鉴定采用流式细胞术。成熟的BMDMs细胞高表达F4/80和CD11b，因此本实验中选择将这两种细胞膜分子作为BMDMs成熟鉴定的表面标志物。标志物双阳率可占总数的85%，表明细胞培养成功(图4)。

2.5 材料对细胞生存活性的影响

图2 各样本红外光谱图

图3 各组样本水接触角

图4 流式细胞仪鉴定BMDMs纯度

图5 各组样品表面BMDMs生存活性

本次实验运用PI单染色法检测早期细胞凋亡。有活性的细胞细胞膜致密完整，而PI是一种核酸染料，致密的细胞膜无法允许PI 进入，故无法染色，而染色细胞则属于凋亡细胞。如图5所示，空白对照组的BMDMs的PI染色率为1.98%，N组(光滑PEEK)为2.79%，3D和2D组分别为2.75%和2.16%，组间无明显差异。可以说改性后的材料对细胞早期生存情况无显著影响。

3 讨论

细胞与种植体之间的相互作用是种植成功的关键环节之一[10]。材料表面的成分、结构、形貌、亲(疏)水性、表面物理、化学及力学特性对生物体均有影响。恰当的材料性质可以提高种植体生物相容性，改善细胞活性，从而达到早期愈合的目的。尤其是空隙结构，为材料表面细胞提供了一个有利的局部微环境[11]。作者通过控制硫酸浓度运用磺化的方法将PEEK处理成3D网状结构和2D孔隙结构。将PEEK材料浸泡于硫酸当中，材料发生磺化反应[12]。当样品从硫酸中取出，形成磺化PEEK仍然处于一种溶胀状态，并且有少量的硫残留表面。随后放置于0 ℃去离子水中，此时PEEK开始从溶胀状态向凝固状态转变。并在此过程中，过量的硫酸向外扩散，使磺化后的材料表面形成许多孔隙。此外化学引入的磺酸基团修饰PEEK化学链，破坏了原有的致密结构，促进了孔隙的形成[13]，最终形成多孔结构。

从水接触角实验可以看到，2D孔隙结构的材料表面水接触角最小，说明材料表面最为亲水，而3D网状结构材料表面水接触角大，材料更为疏水。材料亲疏水性的不同会影响后续蛋白吸附和细胞黏附。有研究表明疏水性材料表面更有利于蛋白质黏附[14]，蛋白吸附在材料表面主要分为两个步骤，首先是蛋白吸附在材料表面，然后蛋白发生构象改变，最终可形成共价键吸附。在疏水性材料表面，蛋白表现出强吸附，而亲水表面，蛋白表现出弱吸附。但如何实现蛋白的选择性吸附少有研究，且对种植成功意义更大。另一方面普遍认为细胞膜具有亲水的寡糖链，呈现一定的亲水性，故亲水性的材料表面更有利于细胞的黏附[15]。作者分析2D结构表面更亲水的原因可能为二，一是因为2D孔隙状结构属于亲水结构；二是磺酸基团是亲水基团，2D组磺酸基团较多。此外，尽管3D组也引入了磺酸基团，但磺化后水接触角反而增大，这表明3D网状的结构表面降低了材料的亲水性。