商洛南五味子醇甲提取及复合保鲜液应用研究

刘庚玫，张晓虎，张峻伟

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛 726000)

0 引言

南五味子为五味子科(Schisandraceae)南五味子属(KadsuraKaempf.exJuss.)南五味子(KadsuralongipedunculataFinetetGagnep.)植物的果实。现代科学研究表明南五味子中含有机酸、木脂素、倍半萜及多糖等多种成分，其中南五味子醇甲、南五味子甲素、南五味子酯甲等木脂素类化合物为其主要活性成分,具有抗氧化、抗炎抗菌、舒张血管、保肝强脾等药理作用[1～6]。

南五味子提取物可诱导果蔬本身防御性酶活力的增强，提高抗病性，有效减缓果蔬采后腐坏，具有食品防腐及果蔬保鲜的良好应用前景[7,8]。马永全等[9]测定五味子提取物的抑菌活性及清除1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(DPPH)、羟自由基(OH)、超氧阴离子(O2-)的能力，研究表明五味子提取物具有明显的抑菌及抗氧化作用。李洪洋[10]对五味子醇甲的抑菌性进行研究，结果表明五味子醇甲对大肠杆菌、黑曲霉、啤酒酵母具有显著的抑菌活性。林雄平等[11]对南五味子根黄酮提取物的抗菌抗氧化活性进行研究，结果表明对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑曲霉、啤酒酵母均有一定程度的抑菌效果。

研究选取商洛南五味子作为对象，采用微波辅助乙醇浸提法提取南五味子醇甲，以其为指标采用响应面法通过高效液相色谱法对南五味子醇甲的提取工艺进行优化。研究南五味子醇甲对三种常见菌抑菌效果，并将南五味子醇甲与普鲁兰多糖、丙三醇、油酸进行复配，将配制的复合防腐保鲜液用于鸡蛋保鲜，为南五味子醇甲应用于蛋类保鲜的研究提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 材料：南五味子干燥果实(购于商洛市商州区福鑫康药业)、当日产新鲜鸡蛋(购于商州区沙河子镇养鸡场)、一次性泡沫包装盒(购于商州区家佳惠超市)。

试剂：五味子醇甲标品(分析纯，购于江苏永健医药科技有限公司)，无水乙醇(分析纯)，琼脂，95%乙醇(分析纯)，甲醇(分析纯)，蒸馏水，胰蛋白胨，普鲁兰多糖，丙三醇，油酸，磷酸(分析纯)。

菌种：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌(购自西安市长安区瑞昇化玻仪器供应站)。

1.1.2 主要仪器 JP-500C型高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；DHG9240A型电热恒温鼓风干燥箱，上海齐欣科学仪器有限公司；HH-4型数显恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；LC-20A型高效液相色谱仪器，日本岛津有限公司；LRH-70F型生化培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；pHS-25型数显pH测试仪，上海始恒仪器有限公司。

色谱条件：色谱柱：ODS-3(C18)(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以甲醇-0.05%磷酸溶液(60∶40)为流动相；流速：1.0 mL·min-1；检测波长为 250 nm[12]；柱温：30℃；进样量：10 μL[13]。

1.2 研究方法

1.2.1 试验材料预处理 将南五味子干燥果实放入高速万能粉碎机粉碎，过60目筛，置于干燥的广口瓶中，密封备用。

1.2.2 标准曲线的制备 称取5mg五味子醇甲标准品，加入甲醇溶解摇匀并定容于10 mL洁净容量瓶中，取上述溶液2、4、6、8、10 mL分别置于洁净试管中，各个试管用甲醇定容至10 mL。加甲醇稀释至10 mL刻度线，按1.1.1色谱条件，分别重复进样3次，测定并记录峰面积。制备标准曲线见图1，回归方程为：y=7E+06x+71418，R2=0.9983。

1.2.3 南五味子醇甲的提取 准确称取5 g南五味子粉末，放入100 mL烧杯中，加入一定浓度和比例的乙醇，浸泡5 min，搅拌均匀，然后置于微波炉提取一定时间，将提取液倒入100 mL容量瓶，用蒸馏水定容，待测[14]。

1.2.4 南五味子醇甲的测定 使用移液枪将不同浓度的南五味子醇甲提取液吸取1.0 mL，用甲醇定容于25 mL容量瓶中，按1.1.1色谱条件重复进样三次，按下式计算提取液中南五味子醇甲的质量浓度[15]。

Y(mg·g-1)=C·N·V/M

式中：C-为回归方程计算出的南五味子醇甲浓度(mg·mL-1)；N-为溶液稀释倍数；V-为提取液体积(mL)；M-为南五味子醇甲粉末质量(g)。

1.2.5 单因素试验 分别考察液料比(1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)、微波功率(200、350、500、650、800W)、乙醇体积分数(55、65、75、85、95%)、提取时间(5、10、15、20、25 min)对南五味子醇甲得率的影响。

1.2.6 响应面法试验 基于单因素试验，进行响应面法优化。以X1、X2、X3为自变量，以南五味子醇甲得率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6.0软件对乙醇体积分数、微波功率和提取时间3个因素进行3水平响应面设计试验，得到最佳优化提取工艺参数，并进行验证实验测评最佳提取工艺参数可靠性。

1.2.7 抑菌性试验 菌悬液的制备：在试管中注入等量无菌水，挑取活化后的菌种接入到无菌水中，震荡，摇匀，制备成浓度为1×105cfu·mL-1的菌悬液备用。

南五味子醇甲抑菌能力测定：南五味子醇甲提取液配制成7个浓度梯度(2.0、1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg·mL-1)，每个浓度3组平行。在37℃、相对湿度67%的条件下培养24 h后取出观察，用十字交叉法测量抑菌圈直径[16]。

1.2.8 复合保鲜液配方制备 单因素试验：分别考察普鲁兰多糖添加量(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 g)、丙三醇添加量(0.5、1.0、1.5、2、2.5 mL)、油酸添加量(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL)、南五味子醇甲添加量(6、7、8、9、10 mL)对鸡蛋保鲜效果的影响。

正交试验：在单因素试验的基础上，选取普鲁兰多糖、丙三醇、油酸、南五味子醇甲添加量4个因素、设置3个水平，采用L9(34)正交实验，优化复合保鲜液配方[17,18]。

1.2.9 复合保鲜液应用 将制备的复合保鲜液用于鸡蛋保鲜，取未处理过的新鲜鸡蛋作为对照组按照相同实验条件在35℃恒温加速贮藏，检测失重率、哈夫单位、蛋白pH及感官品质。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 乙醇体积分数对南五味子醇甲得率的影响 据图2分析可知，南五味子醇甲的提取率随着乙醇体积分数的不断增大先提高而后逐渐降低，乙醇体积分数达到85%后提取率呈下降趋势，究其原因：一是由于溶液极性变强，使木脂素类物质溶解度降低。二是较高的乙醇浓度会分解或破坏南五味子中的有效成分使醇甲含量变低。因此，选取85%为较佳乙醇体积分数。

2.1.2 料液比对南五味子醇甲得率的影响 据图3分析可知，南五味子醇甲得率随着料液比得增加而变大，当料液比为1∶10时得率为2.351 mg·g-1达到此范围最大值；当料液比增加到1∶12时，得率无明显改变。考虑经济效益可选取1∶10作为较佳料液比。

2.1.3 微波功率对南五味子醇甲得率的影响 据图4分析可知，微波功率从350 W增加到500 W时，南五味子醇甲的得率不断增加，当微波功率达到500 W时得率最达。随着微波功率逐渐增大，南五味子内部结构被破坏，导致醇甲得率降低。因此，选取500 W为较佳微波功率。

2.1.4 提取时间对南五味子醇甲得率的影响 据图5分析可知，南五味子醇甲的提取率随着提取时间的不断延长，先增大而后缓慢减小。提取时间达到10 min时醇甲得率达到最大，继续延长时间使细胞与空气接触时间延长同时增加接触面积，其内部发生降解或缩合反应使得率降低。因此，10 min为较佳提取时间。

图2 乙醇体积分数对南五味子醇甲得率的影响

图3 料液比对南五味子醇甲得率的影响

图4 微波功率对南五味子醇甲得率的影响

图5 提取时间对南五味子醇甲得率的影响

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面实验方案与结果 以单因素实验的结果为基础，在固定料液比为1:10的前提下，选择A(乙醇体积分数)、B(微波功率)、C(提取时间)为响应面自变量，设计3因素3水平的响应面试验方案与结果见表1。

2.2.2 回归分析 利用Design-Expert 8.0.6.0对响应面实验结果数据进行分析，得到以编码因子表示的最终方程为：

Y=2.78+0.32A+0.037B+0.16C+0.06AB-0.30AC+0.062BC-0.74A2-0.038B2-0.22C2

表1 响应面试验设计与结果

由表2，该实验所建立的二次多项模型，P模型<0.0001，具有高度显著性。P失拟项=0.031，不显著，表明无失拟因素存在。其中交互项(AC)差异高度显著，乙醇体积分数(A)差异极显著，提取时间(C)差异高度显著。

表2 回归模型系数的显著性检验结果

由表3，南五味子酯甲提取率的变异系数C.V.%可以反应回归方程可信度。校正系数R2Adj=0.9762，表明该回归模型拟合程度好，可以解释97.62%响应值的变化，变异系数C.V=3.36%，说明所得数据具有较高的稳定性。

表3 回归模型方差分析

2.2.3 响应面分析 由图6，乙醇体积分数固定时，南五味子醇甲得率随微波功率的逐渐增加先升高后降低，微波功率在500 W时得率最大；微波功率固定时，醇甲得率随着乙醇体积分数的增加先升高后降低，乙醇体积分数在85%～90 %时南五味子醇甲得率最大；由图7，乙醇体积分数固定时，南五味子醇甲得率随提取时间的增加而变大，提取时间为9～11min时醇甲得率最大；提取时间固定时，得率随乙醇体积分数的逐渐增加先升高后降低，乙醇体积分数在85%时南五味子醇甲得率最大；由图8，微波功率固定，南五味子醇甲得率随着提取时间的延长而缓慢增加，提取时间为9～11 min时醇甲得率达到最大，随后得率趋于稳定变化较小；提取时间固定时，醇甲得率随微波功率的逐渐增加呈现先增长再下降的细微变化，微波功率在500 W时南五味子醇甲得率最大。

图6 乙醇体积分数和微波功率对南五味子醇甲得率的交互影响等高线和响应曲面

图7 乙醇体积分数和提取时间对南五味子醇甲得率的交互影响等高线和响应曲面

图8 微波功率和提取时间对南五味子醇甲得率的交互影响等高线和响应曲面

2.2.4 验证试验 优化工艺条件：料液比1∶10，微波功率为500 W，乙醇体积分数为85%，提取时间为10 min。由响应面试验结果及Box-Benhnken设计给出的最优方案进行南五味子醇甲的提取，检测后发现南五味子醇甲得率为2.824 mg·g-1，优于单因素实验结果可作为优化方案。

2.3 抑菌性实验结果分析

表4表明，南五味子醇甲的抑菌效果顺序为：沙门氏菌<金黄色葡萄球菌<大肠杆菌，大肠杆菌的MIC为0.125 mg·mL-1，对其抑菌效果明显优于金黄色葡萄球菌和沙门氏菌。

表4 南五味子醇甲最低抑菌浓度

2.4 复合保鲜液配方制备及应用

2.4.1 单因素实验结果与分析 普鲁兰多糖含量对鸡蛋保鲜效果的影响：由图9，随着贮藏时间延长，各组鸡蛋均有一定失重，在普鲁兰多糖添加量为6 g时其失重率减轻最缓；由图10，各试验组哈夫单位随时间的延长而减小，其中普鲁兰多糖添加量为6 g和5.5 g时鸡蛋哈夫单位值变化较小，与对照实验组相比保鲜效果较为明显；由图11，各试验组蛋黄指数随时间的延长而减小，空白组下降速度最快，在普鲁兰多糖添加量6 g时蛋黄指数下降较缓，结合以上分析可得普鲁兰多糖添加量为6 g时复合保鲜液保鲜效果较好。

丙三醇含量对鸡蛋保鲜效果的影响：由图12，随着贮藏时间延长，鸡蛋均有一定的失重，其中丙三醇添加量为2.5 mL时鸡蛋重量减轻较缓，比对照实验组低了3.9%；由图13，计算哈夫单位后发现丙三醇添加量为2.5 mL时鸡蛋哈夫单位值变化较小，在同组实验中较高；由图14，丙三醇添加量为2.5 mL和2 mL时蛋黄指数下降稍缓，结合以上分析可得丙三醇添加量为2.5 mL的复合保鲜液保鲜效果较好。

油酸含量对鸡蛋保鲜效果的影响：由图15，随着贮藏时间延长，鸡蛋均有一定的失重，其中油酸添加量为3 mL时鸡蛋重量减轻较缓，比对照实验组低了3.2%；由图16，计算哈夫单位后发现油酸添加量为3 mL时哈夫单位值变化较小，在同组实验中较高，为53 Ha。可能由于添加较高的油酸黏度及稳定性较好，能更好的成膜保护鸡蛋；由图17，油酸添加量为3 mL和3.5 mL时蛋黄指数下降较缓，结合实验数据可得油酸添加量为3 mL时保鲜效果较好。

南五味子醇甲提取液对鸡蛋保鲜效果的影响：由图18，贮藏时间延长使鸡蛋均有一定的失重，使用10 mL五味子醇甲溶液的鸡蛋重量减轻较缓，比对照实验组低了3.1%；由图19，计算哈夫单位后发现南五味子醇甲添加量为10 mL时其鸡蛋哈夫单位值变化较小，经15 d 35℃恒温保藏后为52 Ha，与对照试验组相比保鲜效果明显；由图20，各试验组蛋黄指数随时间的延长而减小，空白组下降速度最快，在南五味子醇甲添加量分别为9 mL与10 mL时蛋黄指数下降较缓，结合实验数据可得南五味子醇甲添加量为10 mL时保鲜效果较好。

图9 普鲁兰多糖添加量对鸡蛋失重率的影响

图10 普鲁兰多糖添加量对哈夫单位的影响

图11 普鲁兰多糖添加量对蛋黄指数的影响

图12 丙三醇添加量对鸡蛋失重率的影响

图13 丙三醇添加量对哈夫单位的影响

图14 丙三醇添加量对蛋黄指数的影响

图15 油酸添加量对鸡蛋失重率的影响

图16 油酸添加量对鸡蛋哈夫单位的影响

图17 油酸添加量对蛋黄指数的影响

图18 南五味子醇甲添加量对鸡蛋失重率的影响

图19 南五味子醇甲添加量对鸡蛋哈夫单位的影响

图20 南五味子醇甲添加量对蛋黄指数的影响

2.4.2 正交试验结果与分析 由表5，在35℃恒温贮藏条件下，不同配方复合保鲜液处理的鸡蛋与空白组相比失重率均为上升趋势，哈夫单位值呈下降趋势。结果表明，经10 mL五味子醇甲溶液+5.5 g普鲁兰多糖+1.5 mL丙三醇+3.5 mL油酸处理过的鸡蛋保藏效果较好。

2.4.3 复合保鲜液应用 通过以上正交试验选择出最佳的复合保鲜液配方为A3B2C1D3，将制备的复合保鲜液应用于鸡蛋，取未处理过的新鲜鸡蛋作为对照组按照相同实验条件在35℃恒温加速贮藏5 d，检测贮藏后鸡蛋的失重率、哈夫单位及感官品质见表6。

表5 正交试验方案及结果与分析

表6 35℃加速贮藏后鸡蛋感官评定结果

3 结论与讨论

3.1 结论

(1)基于单因素进行响应面试验的方法得到商洛南五味子醇甲的优化提取工艺为：料液比1∶10的条件下，微波功率500 W、85%的乙醇体积分数提取10 min，南五味子醇甲的得率为2.824 mg·g-1。

(2)南五味子醇甲的抑菌效果顺序为：沙门氏菌<金黄色葡萄球菌<大肠杆菌；其对大肠杆菌的抑菌效果最为显著，MIC为0.125 mg·mL-1。

(3)制备的复合保鲜液最优配方为：10 mL南五味子醇甲溶液、5.5 g普鲁兰多糖、1.5 mL丙三醇、3.5 mL油酸，将其应用于新鲜鸡蛋后，35℃恒温贮藏，与空白对照实验组对比，使用复合保鲜液后的鸡蛋保藏效果要优于空白对照组，能延长贮藏期15 d。

3.2 讨论

(1)研究通过微波辅助乙醇浸提法提取木脂素类物质南五味子醇甲，利用高效液相色谱仪测定其得率，得到南五味子醇甲的优化提取工艺，与其他提取方法如乙醇回流、超临界萃取法相比操作简便、省时省力，适用于大批量的提取，可明显节约成本。提取的南五味子醇甲略低于黄惠华的试验得率[19]，究其原因：一是由于购买的干制南五味子在采摘时错过了南五味子醇甲含量最高的时期，导致部分南五味子醇甲分解；二是由于粉碎程度不够细小，未能将有效成分全部提取。试验的抑菌效果顺序与吴少辉的研究结论一致[7]。

(2)研究能够较好地提取并检测南五味子醇甲，探讨了一条较为精准、可操作的实验方法。南五味子醇甲具有一定的清除自由基、保鲜防腐效果，利用南五味子醇甲与普鲁兰多糖、丙三醇、油酸进行复配并应用于蛋类保鲜中，可为蛋类制品的贮藏及运输销售的防腐保鲜提供一定的参考依据。

(3)建议今后研究注意：尽量在南五味子花期结束后就进行采摘，最大程度避免因采摘期不当造成的得率偏差；可进行多次粉碎以尽可能增大与溶剂的接触面积提高提取率；鉴于南五味子果核与果肉中的醇甲含量差别较大，今后可分别进行研究。