RNA N6-腺苷酸甲基化修饰在慢性肝病中作用的研究进展

申 敏，李余佳，邵江娟，2，3，张 峰，2，3，张自力，2，3，郑仕中，2，3

〔南京中医药大学1.江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，2.江苏省中药功效物质重点实验室，3.中药品质与效能国家重点实验室（培育），江苏 南京210023〕

肝是人体最大的器官，具有代谢解毒等多种生理功能。肝功能主要由肝细胞执行，肝细胞是肝中最主要的实质细胞，参与包括蛋白质、碳水化合物和脂质的代谢处理、异源化合物的解毒以及必需分子的分泌［1］。肝的非实质细胞包括胆管细胞（上皮细胞）、肝窦内皮细胞、肝星状细胞、库普弗细胞和其他免疫细胞包括淋巴细胞，通过旁分泌因子与肝细胞相互作用，调节肝功能。长期慢性肝损伤包括乙型肝炎和（或）丙型肝炎病毒感染、过量饮酒、药物性肝损伤、自身免疫性疾病和遗传因素等［2-3］造成的慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌等已成为全球主要的公共卫生问题之一，严重威胁着人们的身心健康，给社会带来重大经济负担。据统计，全球约有8.44亿慢性肝病患者，每年导致约200万人死亡［1，4］。

转录后调控是指在转录后对基因表达的调控，是对真核生物基因的转录产物进行的一系列修饰和加工，包括RNA分子整个生命周期中的多种过程，如加工、输运、翻译和降解等［5］。与RNA的转录调控相比，转录后调控对蛋白表达量的微调能力以及对疾病局部控制的能力具有更显著的优势［6］。已知细胞RNA 在转录后会动态可逆地经历不同的化学修饰，如N6-腺苷酸甲基化（N6-methyladenosine，m6A）、m1A、N6，2′-O-腺苷酸二甲基化（m6Am）和5-胞嘧啶甲基化（m5C）等。转录后的动态修饰通过调节靶RNA的转运、加工、剪接、翻译和降解等，调控靶RNA的命运，进而影响疾病的进程。其中，m6A修饰是真核细胞RNA最丰富的内部修饰，与调控RNA的代谢密切相关。有研究表明，m6A修饰在胚胎发育、肿瘤形成和神经元生成等生理过程中发挥重要作用［7］，并且m6A修饰在调节细胞内稳态方面也发挥重要作用［8］。

研究发现，m6A 修饰在病毒性肝炎、肝纤维化、肝脂代谢紊乱、非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）和肝癌等慢性肝病中发挥重要的生物学和临床作用。研究特定转录本的m6A 修饰水平的调节机制及其在慢性肝病中发挥的作用，设计或筛选靶向调控m6A 修饰相关酶的新型药物将为慢性肝病的治疗带来希望。本文对m6A修饰在慢性肝病中的作用予以综述。

1 m6A修饰

m6A 是RNA 中N6位的腺苷酸发生的甲基化修饰，是真核RNA 中最普遍的内部修饰，能够调控多种生理事件，已引起研究者的极大兴趣［9］。转录组图谱显示，m6A 修饰存在于大量RNA 转录本中，但其功能和机制仍然未知。现已明确，m6A修饰是一个可逆的过程，受m6A修饰相关的“编辑器（writers）”和“消码器（erasers）”酶的平衡调节。研究表明，m6A修饰嵌入在mRNA 的共有序列5′-RRACU-3′（R=A 或G）中，前期对mRNA 的拓扑研究表明，m6A 修饰通常出现在mRNA 的3′非编码区。随后，mRNA中5′端的m6A 修饰也被发现，并已揭示其与蛋白质翻译密切相关［10-11］。

哺乳动物细胞中，m6A 的修饰是由甲基转移酶复合物催化的，该复合物包含甲基转移酶样3（methyl⁃transferase like 3, METTL3），METTL14 和维尔姆斯瘤蛋白1 相关蛋白（Wilms tumor 1-associated protein，WTAP）［12］。METTL3 和METTL14 均含有S-腺苷甲硫氨酸结合基序，在WTAP 的帮助下，在核中共定位并形成异二聚体，催化甲基与腺嘌呤共价结合［13］。此外，一些新的甲基化酶被陆续发现，如KIAA1429 和RNA 结合基序蛋白15 已被鉴定为m6A 修饰转移酶复合物的新成员［14］。Wen 等［15］研究表明，锌指CCCH 结合域蛋白13（zinc finger CCCH domain-containing protein，ZC3H13）是一种新的RNA m6A修饰调节因子，可促进小鼠胚胎干细胞的自我更新。Chen等［16］发现了一种新的m6A修饰甲基化转移酶ZCCHC4，它在肝癌组织中高表达，与肝癌的发展密切相关。相反，α-酮戊二酸依赖双加氧酶ALKB同源蛋白5（α-Ketoglutarate-dependent dioxygenase ALKB homolog 5，ALKBH5）和去甲基化酶肥胖相关蛋白（fat mass and obesity-asso⁃ciated protein，FTO)作为哺乳动物RNA 去甲基酶能够逆转m6A 修饰。去甲基化酶FTO 和ALKBH5都属于ALKB 双加氧酶家族。ALKBH5 可直接去除RNA 的m6A 修饰，去甲基化酶FTO 可将m6A 依次氧化成稳定的N6-羟甲基腺苷（Hm6A）和N6-甲酰腺苷（F6A），随后可水解成腺嘌呤。

m6A 修饰的生物学功能主要是通过改变RNA结构或招募m6A 修饰识别蛋白来发挥的。目前研究的主要有3 类m6A 修饰识别蛋白。①m6A 修饰识别蛋白含有一个进化上保守的YTH 结构域，可直接与m6A 结合。研究表明，人类基因组中有5 个YTH结构域蛋白，包括YTHDF1～3和YTHDC1～2，也是主要的m6A 修饰识别蛋白。其中，YTHDF2 是第一个被鉴定也是研究最多的m6A 修饰识别蛋白，通过与位于3′UTR 的m6A 结合，能够影响mRNA的稳定性或加速靶mRNA 的降解［17］。此外，Du等［18］报道，YTHDF2 能够招募C-C 基序趋化因子受体4-NOT 去腺苷化酶复合物以促进mRNA 降解。另一方面，YTHDF1 识别m6A 修饰的mRNA，提高mRNA 的翻译效率［11］。YTHDF1 结合翻译起始复合物真核起始因子3 促进m6A 修饰mRNA 的蛋白翻译。YTHDF3 和YTHDF1 通过与翻译相关元件相互作用促进蛋白质合成，YTHDF3 也能够提高m6A修饰RNA的降解率。曾有研究者认为，YTHDF2和YTHDF1 的拮抗功能可能在调节其共同靶点的mRNA降解和翻译之间的平衡中起重要作用。最新研究也证明，YTHDF3 能够首先识别m6A 修饰的mRNA 前体，然后YTHDF1和YTHDF2竞争性结合YTHDF3 来调节靶基因的表达［19］。YTHDC1 是一个介导RNA 剪接的m6A 修饰识别蛋白，可募集mRNA 剪接因子富含丝氨酸和精氨酸的剪接因子3（serine and arginine rich splicing factor 3，SRSF3）和SRSF10 分别促进外显子融合和缺失。此外，YTHDC1 还通过与SRSF3 和核RNA 输出因子1 相互作用来控制核孔输出［20］。YTHDC2 与RNA 解旋酶相互作用，正向调节翻译的延伸［21］。②m6A 修饰识别蛋白包括3 种异质核糖核蛋白，即核不均一核糖蛋白C（heterogeneous nuclear ribonucleopro⁃tein C，HNRNPC），HNRNPG 和HNRNPA2B1。这些蛋白质通过“m6A-开关”选择性地与含有m6A 修饰的转录本结合。在这种机制中，m6A 修饰削弱正常的碱基配对，破坏RNA 的稳定，从而暴露单链HNRNP 结合基序。曾有研究表明，HNRNPC 和HNRNPG 可以作为潜在的细胞核内RNA 的m6A修饰识别蛋白，影响mRNA 的定位和选择性剪接［22］。另一个HNRNP 成员HNRNPA2B1 与m6A 修饰的微RNA 前体结合，并招募相关复合体来促进微RNA 的成熟［23］。③胰岛素样生长因子2 结合蛋白1/2/3（insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1/2/3，IGF2BP1/2/3）是第3 类m6A 修饰识别蛋白。这类蛋白质具有共同的RNA结合域，如识别含有m6A 修饰的转录本的KH 结构域。然而其确切的调控机制仍不清楚。IGF2BP 蛋白优先与含有m6A 修饰的转录本结合，其结合基序UGGAC 与m6A 修饰共有序列RRACH 重叠。IGF2BP 蛋白通过招募RNA 稳定因子如HUR 来发挥其功能，以保护m6A 修饰的mRNA 不被降解。上述m6A 修饰识别蛋白具有多种功能，参与调节RNA代谢的几乎每一步，包括含有m6A 修饰的转录本的稳定性、翻译和剪接。

综上所述，m6A 修饰相关的甲基化、去甲基化酶和识别蛋白共同参与靶RNA的转录后调控（图1）。

2 m6A修饰在慢性肝病的作用

图1 N 6-腺苷酸甲基化（m6A）调控模式. METTL3：甲基转移酶样3；WTAP：维尔姆斯瘤蛋白1 相关蛋白；KIAA1429：病毒样m6A 转移相关蛋白；ZC3H13：CCCH 型锌指蛋白；FTO：肥胖相关蛋白；ALKBH5：ALKB同源蛋白5；HNRNP：核不均一核糖核蛋白；YTH：YTH结构域蛋白；IGFBP：胰岛素样生长因子结合蛋白.

m6A修饰的动态调控影响大量的基因表达及其相关的信号通路转导，并进一步影响疾病的进程。RNA 的m6A 修饰可以调节几种重要肝病的进程，如病毒性肝炎、肝纤维化、NAFLD 和肝癌等（表1）。并且肝发挥生理功能的任何特定阶段都需要不同水平的m6A修饰调控［24］。可见，RNA m6A修饰对肝病进程有重要影响。

2.1 病毒性肝炎

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）感染是慢性肝病的常见原因。HBV 是一种DNA 病毒，主要通过前基因组RNA 的调控来完成其生命周期，Imam 等［25］发现，HBV mRNA 的3′端m6A 修饰导致所有HBV转录本不稳定，而前基因组RNA 的5′和3′端m6A修饰使其转录稳定，提示m6A 修饰对HBV RNA 具有双重调节功能。Tan 等［26］发现，m6A 修饰能够抑制病毒包装从而负调控HCV 的复制。当被HCV 感染时，YTHDF 蛋白重新定位到脂滴，即病毒组装的位置抑制病毒复制［27］。m6A 修饰识别蛋白YTHDF2 或YTHDF3 能 够与m6A 修 饰的RNA 结合抑制视黄酸诱导因子1 转导信号，可能是HBV 和HCV 逃避免疫调控的原因［28］。慢性HBV 和HCV感染是肝细胞癌的最主要原因，而m6A 修饰识别蛋白与病毒RNA 相互作用的具体机制在很大程度上仍未知。研究发现，m6A 修饰在慢性肝炎病毒中可能存在双重调节作用。阐明m6A修饰在肝慢性病毒感染及其免疫逃逸中的作用，为病毒性肝炎的防治提供新思路。

2.2 肝纤维化

肝纤维化是一个动态的创伤愈合过程，在慢性刺激下正常肝会发生肝纤维化，并进一步发展为肝硬化甚至肝癌。在这个过程中，肝星状细胞的持续激活导致细胞外基质过度沉积，从而破坏肝的结构和功能。研究证实，肝纤维化是一种可逆性瘢痕修复反应，在其形成过程中进行适当的干预可以阻断甚至逆转肝纤维化。研究发现，黄曲霉毒素B1 诱导的肝细胞凋亡与m6A 修饰密切相关，m6A 修饰通过调节胱天蛋白酶3 依赖的途径参与细胞凋亡［29］。Feng 等［30］报道，慢性皮质醇诱导的鸡肝炎和纤维化中，热休克蛋白水平降低；进一步研究发现，慢性皮质醇处理后甲基化酶METTL3 表达上调，使热休克蛋白mRNA 的m6A 修饰水平升高，降低其mRNA的稳定性，诱导鸡肝炎和纤维化。肝纤维化是各种慢性肝病发展的共同病理过程，其潜在机制和复杂的调控网络尚不清楚，治疗肝纤维化的选择有限。m6A修饰在肝纤维化中的研究较少，因此从转录后调控机制特别是m6A修饰角度，寻找有效的抗肝纤维化治疗策略具有重要意义。

表1 m6A调控因子在慢性肝病中的作用

2.3 非酒精性脂肪肝病

肝是机体物质代谢的中枢，其脂质代谢紊乱将导致肝甘油三脂或脂肪的堆积，与胰岛素抵抗和肥胖等代谢综合征密切相关，多项研究表明，m6A修饰能够调控肝脂质代谢。Luo等［31］利用数据库分析后提出，m6A 修饰通过RNA 结合蛋白Ago2 作用于脂代谢相关基因调控肝脂质代谢。Lu等［32］报道，中药活性成分姜黄素可影响m6A 修饰相关酶METTL3，MELLT14 和ALKBH5 等表达，提高肝m6A 修饰水平，从而增加p53 mRNA 表达，保护肝损伤和脂质代谢。METTL3 调控脂肪酸合成酶的m6A 修饰，促进脂肪酸代谢，抑制肝胰岛素抵抗［33］，YTHDF2 结合m6A 修饰的PPARα，调节其mRNA 的稳定性，促进肝脂代谢［34］。关于肝癌细胞脂肪生成研究，Zuo等［35］报道，METTL3介导长链非编码RNA LINC00958的m6A 修饰，并通过miR-3619-5p 上调肝癌衍生生长因子的表达，从而促进肝癌细胞中的脂肪生成，提示调控肝m6A 修饰可能是恢复肝脂质代谢的有效手段。

NAFLD 主要以肝脂肪变性为主要特征。研究发现，肥胖相关蛋白FTO 通过降低m6A 修饰调控脂肪生成，如干扰肥胖相关蛋白FTO 的表达，使成脂基因CCAAT 增强子结合蛋白、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ）、Fas细胞表面死亡受体和乙酰辅酶A 羧化酶表达显著降低，而脂肪甘油三酯脂肪酶的表达显著增加，甲基化酶METTL3 上调m6A修饰抑制肝脂肪生成相关基因表达［36-37］。在NAFLD 患者肝中发现，FTO mRNA 和蛋白水平显著增加［36］。在NAFLD 大鼠中也发现，FTO mRNA和蛋白水平升高，并表明其与氧化应激和脂质沉积有关［38］。Hu 等［39］报道，糖皮质激素受体介导FTO的活化，降低脂肪生成基因的m6A 修饰，参与NAFLD 的发生。甜菜碱可以降低肝内FTO 表达，减少新生脂肪生成并增加脂肪分解以保护小鼠免受NAFLD 的影响［40］。总之，上述研究为肥胖相关蛋白FTO 作为m6A 修饰的去甲基化酶在调节肝脂肪代谢中的作用提供了新的视角。

2.4 肝细胞癌

肝细胞癌的发生多与长期的慢性肝损伤有关，如HBV 或HCV 感染或乙醇刺激等。以往研究已经表明，m6A 修饰能够调控癌基因表达。最新研究显示，m6A 修饰与肝癌细胞增殖、分化、侵袭和转移密切相关。在肝癌进程中，m6A 修饰水平显著增加［41］。Qu 等［42］利用癌症基因组图谱和国际癌症基因组联合会数据库中的数据分析发现，甲基化调控因子YTHDF1，YTHDF2，METTL3 和KIAA1429 是肝细胞癌发展过程中的关键调控因子，这些因子的发现对预测和治疗肝细胞癌具有潜在的应用价值。此外，甲基化酶METTL3 在肝癌中显著上调，可能作为肝癌潜在的预后生物标志物［43］。去甲基化酶FTO 降低癌基因19、TEA 结构域转录因子2（TEA domain transcription factor 2，TEAD2）mRNA 稳定性，过表达去甲基化酶FTO 能够抑制肿瘤生长。Zhou 等［44］在临床样本中发现，m6A 修饰相关因子METTL3 和YTHDF1 在肝癌患者中显著上调。将YTHDF1 共表达基因进行GO 和KEGG 通路分析发现，YTHDF1 在调控肝癌细胞周期进程和代谢中发挥重要作用［45］。进一步研究发现，丙酮酸脱氢酶激酶4（pyruvate dehydrogenase kinase 4，PDK4）的5′UTR 与YTHDF1/真核翻译延伸因子2 复合物以及IGF2BP3 结合，调节PDK4 稳定性进而调控肝癌细胞的糖酵解［46］。Ding 等［47］也报道，G 蛋白亚单位α mRNA 的m6A 修饰增加并与YTHDF1 结合，使其表达增加并与转录激活因子信号转导与转录激活因子3 相互作用，促进肝癌细胞的生长和转移。Hou 等［48］也发现，肝癌患者组织中m6A 修饰水平增加，并伴随着YTHDF2 的降低。YTHDF2 能够直接结合表皮生长因子受体3′UTR 的m6A 修饰位点，促进肝癌细胞表皮生长因子受体的降解，抑制了肝癌细胞增殖和生长［49］。总之，上述发现对理解靶向人类肝癌中m6A 修饰提供了新的治疗靶标和方向。

3 结语

综上所述，m6A 修饰作为真核生物RNA 最丰富、最重要的内部修饰，在慢性肝病进程中发挥了重要作用。m6A修饰水平可能是慢性肝病早期诊断的潜在指标，m6A 修饰相关酶可能是治疗肝病的潜在靶点。m6A修饰与病毒性肝炎进展密切相关。在HCV 和HBV 中，m6A 修饰能调控病毒的感染和复制，但其在病毒性肝炎中的作用尚存在争议，因此其对肝炎病毒的调控作用仍需深入研究。m6A修饰在肝纤维化中的研究较少，而肝纤维化是各种慢性肝病的共同病理过程，m6A 修饰对肝纤维化的调控能够抑制慢性肝病的进展。NAFLD 的发病机制是一个复杂的过程，涉及多种调控机制，包括脂肪生成、脂肪堆积、胰岛素抵抗和内质网应激等。研究表明，m6A 修饰参与肝胰岛素抵抗和脂质的积累。此外，m6A 修饰与肝癌的发生密切相关，在肝癌中m6A 修饰调节因子特异性地调控mRNA 的剪接、翻译和降解等。探究m6A 修饰在肝癌中的调控机制，可为肝癌治疗提供新策略。但m6A 修饰在慢性肝病中的研究尚存在较大空间，待深入探讨。