基于短引物扩增应用的龙牙百合主要病毒鉴定

周楚人 ，郝晓峰 ，刘一涵，陈咸吉 ，肖扬波 ，曾露芝 ，向蒙，刘甫智，李桂阳，汪启明*，彭国平*

（1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙 410128；2道地药用植物规范化栽培与综合利用湖南省工程实验室，湖南长沙 410128；3湖南一线情农业有限公司，邵阳 422208；4湖南省康润农业科技发展有限公司，怀化 418013）

龙牙百合（Lilium brownie var.virdulum Baker），是我国一种珍贵的稀有和畅销的特产蔬菜，是湖南长期栽培的百合地方良种，在湖南邵阳有1 800多年的种植历史，因其鳞片肥大，形似龙牙而得名，是百合中最名贵的品种之一。它鳞茎个体肥厚、抱合紧密、结拜细嫩、颜色鲜艳、品质优良、营养丰富，具有安神宁心、补中益气、养阴润肺、理脾健胃等功效，有较高的营养价值及药用价值［1-3］。

龙牙百合多采用无性繁殖，易造成病毒累积，严重危害其产量和品质。目前已报道侵染百合的病毒达19种以上，最主要的为百合斑驳病毒（Lily mottle virus，LMoV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）和百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）［4，5］。这3种病毒通常以其中2或3种同时侵染百合植株，给百合生产造成严重影响［6-8］。研究表明，病毒侵染后的表现包括幼叶向下反卷扭曲、系统花叶、坏死斑、花叶出现斑点或花叶卷曲，植株矮化呈从簇状，甚至无花、植株无主秆等症状，造成百合切花或鳞茎品质严重下降。而植株一旦感染则终身携带，通过蚜虫或汁液传播，病毒传播范围进一步扩大［9-11］。

为保证龙牙百合质量，栽培无毒种球是防控百合病毒性病害的根本措施，而有效的病毒检测技术是确保脱毒苗真正无毒的有效措施。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料于2020年6月取自湖南省邵阳市隆回县三阁司镇（27.116415°N，110.978235°E）龙牙百合发病田，以5点法取样获得数株染病龙牙百合。

1.2 仪器与试剂

实验仪器：实时荧光定量PCR仪ABI7500、超净工作台BIOBAS、微量移液器Eppendorf、漩涡混匀仪Kylin-Bell、掌式离心机Kylin-Bell、热循环仪ABI Proflex、电泳仪（上海天能科技有限公司）。

实验试剂：DEPC处理水（R1600）Solarbio、三氯甲烷（10006818，国药集团化学试剂有限公司）、Gel-Red染 料（#41003）Biotium、RNA Loading Buffer（9168）TaKaRa、Tris-Borate-EDTA Buffer（TBE）10×Powder，pH8.3（T9122）TaKaRa、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（FP205-02）天根、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（K1622）ThermoFisher、RNAsimple Total RNA Kit（DP419）天根。

根据NCBI Genebank（The National Center for Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）中登录的百合CMV、LMoV、LSV病毒基因序列，应用Primerpremier 6.0软件分别设计3种病毒的特异性引物。LMoV-99、LMoV-101、LSV-70、LSV-169、CMV-110、CMV-70由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见表1。

表1 实验所用引物序列Table 1 Primer sequences used in experiments

1.3 龙牙百合总RNA的提取

使用Hipure HP Plant RNA MiNi Kit提取植物总RNA小提试剂盒，按说明书提取总RNA。

1.4 RT-PCR法检测龙牙百合病害种类

利用RT-PCR法进行龙牙百合主要病毒的检测。采用引物LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F、LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F，从总RNA提取液中分别扩增CMV、LMoV、LSV等病毒，根据RT-PCR试剂盒操作说明，设定RT-PCR体系为：（1）体系中加入RNA（90～100 ng/uL）11μL、Random lexamer Primer 1μL，混匀离心，PCR仪上65℃反应5 min，立即置于冰上冷却，离心后放置冰上。（2）体系中加入5×Reaction Buffer 4μL、Ribolock RNase Inhibition 1μL、10 mM dNTP Mix 2μL、ReverlAid M-MuLV RT 1μL，混匀离心。（3）PCR仪中25℃作用5 min，然后42℃作用60 min，70℃作用5 min，终止反应。（4）补加20 μL NF-H2O至40μL，获得cDNA并做好标记，随后检测。（5）在冰上配制如下反应体系：2×Super-Real PreMix Plus 10μL，相应上下游混合引物10 μM，cDNA 2μL、RNase-free H2O 7.4μL，混匀离心。（6）95℃预变性15 min，95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s。45个循坏进行PCR，产物检测溶解曲线［12，13］。

2 结果

2.1 总RNA提取结果

使用美吉生物科技有限公司提取植物总RNA小提试剂盒从龙牙百合鳞茎组织提取总RNA，用分光光度仪检测8份龙牙百合引物总RNA提取液的浓度和纯度，检测结果如表2。其A260/A280值基本在2.0左右，表明纯度高，可以进行下一步实验。

表2 百合提取RNA的纯度与浓度Table 2 The purity and concentration of RNA extractedfrom Lily

2.2 病毒检测结果

图1 各引物RT-qPCR扩增曲线Fig.1 RT-qPCR amplification curve of each primer

采用引物LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F、LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F从总RNA提取液中分别扩增CMV、LMoV、LSV等病毒。对RT-qPCR产物检测，其扩增曲线如图1，溶解曲线如图2，CT（Cycle threshold）值如表3，凝胶电泳图如图3。LMoV99、LMoV101引物的反应产物扩增曲线结果较好，虽然其CT值不稳定，但都小于35，LMoV-99引物的反应产物溶解曲线Tm值集中在85.5℃左右，且均为单一峰，而LMoV-99引物的反应产物溶解曲线Tm值集中在84.5℃左右。部分实验组存在多峰现象，可能出现了非特异性扩增。LSV-70、LSV-169、CMV-110、CMV-70引物的反应产物扩增曲线虽然CT值大部分小于35，但其溶解曲线Tm值小于80℃，且样本间差异极大，可能是引物间发生了非特异性扩增。

图2 各引物RT-qPCR溶解曲线Fig.2 RT-qPCR Melting curve of each primer

凝胶电泳结果显示，LMoV-99、LMoV-101引物扩增PCR产物的片段长度在100 bp左右，符合预期设计所能扩增出的片段长度，而LSV-169、CMV-70引物扩增PCR产物的片段长度在50 bp以下，不符合预期片段长度，而LSV-70基本没有获得PCR产物。

表3 百合病毒cDNA的qPCR循环阈值Table 3 qPCR cycle threshold table of lily virus cDNA

续表3

图3 龙牙百合各引物PCR结果Fig.3 PCR results of different primers of Lilium longicornis

3 讨论

在采用RT-PCR检测百合病毒的文献报道中，大多数通过RT-PCR产物中有无病毒的特异片段来判断被检测的百合是否感染该病毒［14-16］。笔者在对隆回龙牙百合3种主要病毒CMV、LMoV、LSV的检测过程中，以95℃预变性15 min，95℃变性10 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，45个循坏的PCR参数进行RT-qPCR，但只有采用LMoV-99 R/F、LMoV-101 R/F引物进行qPCR时，溶解曲线、扩增曲线符合预期，CT值在15～25之间，之后进行的普通PCR进行凝胶电泳的结果也表明扩增出了LMoV病毒的片段，而以LSV-70 R/F、LSV-169 R/F、CMV-110 R/F、CMV-70 R/F引物进行PCR扩增时，溶解曲线紊乱，扩增曲线显示CT值普遍在35左右，可以认为是引物二聚体，并没有扩增出CMV病毒和LSV病毒的特异片段。

4 结论

根据以上实验结果，可以判断隆回县龙牙百合感染了百合斑驳病毒，而未感染百合无症病毒及黄瓜花叶病毒。此外，谢晚彬等［17］对江西万载的龙牙百合进行主要病毒检测，发现万载龙牙百合感染了百合斑驳病毒，没有感染黄瓜花叶病毒和百合无症病毒，与本实验结果一致。笔者认为可能病毒本就存在于龙牙百合种球内，随后在田间传播；也有可能龙牙百合对黄瓜花叶病毒和百合无症病毒有较高的抵抗力，而对百合斑驳病毒抵抗力较弱，易感百合斑驳病。