保乳手术治疗早期乳腺癌的疗效及miR-21和miR-155表达的研究

王卫芹，牛 烁，陈学东

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，病变进展时常伴有转移，预后差[1]。乳腺改良根治术是重要的术式，但是损伤大，患者术后心理负担重，生活质量差。早期乳腺癌，尤其是前哨淋巴结无累及的患者适用于保乳手术[2]。微小RNA(MicroRNAs,miRNAs)通过调控其基因功能参与肿瘤的形成和进展，近年来认为其可参与乳腺癌的进展，可能与预后有关[3]。本研究关注保乳手术对早期乳腺癌的治疗效果，同时观察组织中微小RNA-21(MicroRNA-21,miR-21)和miR-155的表达，探讨其临床意义及与预后的关系。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集2013年1月-2014年5月在涿州市中医医院普外科行手术治疗的124例早期乳腺癌患者作为研究对象。纳入标准：①有明确的病理诊断，且符合WHO的诊断标准；②经术中冰冻及术后病理明确前哨淋巴结无转移；③肿瘤最大径<3 cm。排除标准：①合并严重内科疾病；②转移癌；③依从性差。患者均为女性，年龄23～78岁，平均58.4岁，其中原位癌39例，微浸润性癌25例，浸润性癌60例。应用保乳手术进行治疗的患者62例，列为观察组，患者年龄23～78岁，平均57.4岁，分子分型：管腔A型20例，管腔B型20例，HER-2亚型16例，基底细胞亚型6例。应用改良根治手术治疗的患者62例，列为对照组，患者年龄25～77岁，平均59.4岁，分子分型：管腔A型19例，管腔B型22例，HER-2亚型17例，基底细胞亚型4例。两组在年龄及分子分型中的差异无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准，患者或家属签定知情同意书。

1.2 手术方法 观察组应用保乳手术行原发肿物切除、乳腺区段或象限切除，切缘距离肿瘤>2 cm，经术中冰冻及术后病理明确前哨淋巴结无转移。肿物内、外、上、下、基底部分别作标记行冰冻切片病理检查，病理检查切缘结果均为阴性后缝合。对照组应用传统的乳腺癌改良根治术进行治疗，均留取术后的新鲜标本，于-80 ℃冰箱中冻存。

1.3 术后治疗方法 观察组患者术后行常规放疗，共25次。部分患者依情况选择化疗，于手术后2～4周进行，选择阿霉素、环磷酰胺、5氟尿嘧啶方案，进行2～6个周期。针对ER、PR阳性患者于化疗结束后服用三苯氧胺20 mg/d。针对HER-2阳性表达的患者，应用赫赛汀治疗。对照组部分患者术后行放、化疗，方法同上。

1.4 随访 应用电话随访、电子邮件及家访等形式进行随访，每半年一次，于术后3年及5年观察生存情况。

1.5 乳腺癌复发 指经病理证实的乳腺癌，经过治疗后，在原发灶附近或远隔器官出现病理性质完全相同肿瘤的现象。

1.6 生活质量评价 术后5年随访时进行生活质量的调查，应用SF-36量表，共包含8个维度，即总体健康、生理功能、生理职能、躯体疼痛、活力、社会功能、情感职能及精神健康，每个维度分值为100分，得分越高，生活质量越好。

1.7 miR-21和miR-155的检测 miR-21和miR-155的检测应用实时荧光定量PCR法(qRT-PCR)。术后留取的样本均于取材后3个月内集中检测。试剂盒购自美国Invitrogen公司。操作严格按说明书进行。首先配制1%的DEPC水，并将实验用EP管、剪刀、研磨棒、研钵、移液枪枪头等用1%的DEPC水浸泡12 h，高压灭菌。用液氮预冷研钵，取冻存样本，应用研磨棒研磨成粉末状，待液氮挥发完全，用枪头吸头宽口刮取粉末加入1.5 mL离心管中，加入1 000 μL Trizol试剂(购自美国Invitrogen公司，货号:10296010)后按照试剂盒说明书步骤提取总RNA，使用紫外分光光度计(品牌：RUNQEE，型号：UV-1900)测定浓度和纯度。miR-21引物上游：5′-CTCAACTGTGAACTGGAGG-3′，下游：5′-ACAAACCCAAACTGGGTG-3′；miR-155引物上游：5′-GCAAACGTTGAGTAACCAC-3′，下游：5′-CGACAACCACAACGTTAA-3′。RNU6B上游：TCGTGATAGTGATGATCCAGCCA，下游：CGTAGTAGTACAGATAGTAGATGA。逆转录合成cDNA。将提取的总RNA稀释至浓度为2 ng/μL。反应条件为16 ℃、30 min，42 ℃ 、30 min，85℃、5 min，4 ℃恒温。实时qRT-PCR反应，反应条件为95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，32个循环。所得结果平均阈值循环数(Ct值)，按2-ΔΔCT计算，以Relative Quantity(RQ)表示。

2 结果

2.1 两组患者随访生存率的比较 对照组60例患者完成随访(1例因意外死亡，1例因脑出血呈植物状态剔除)，观察组均完成随访。观察组与对照组3年和5年生存率差异无统计学意义，表1。

表1 两组随访3年和5年生存率的比较

2.2 两组患者术后5年随访生活质量的比较 随访患者均完成问卷调查。结果显示观察组患者在8个维度的评分均高于对照组,表2。

表2 两组患者术后5年随访生活质量的比较

2.3 观察组miR-21和miR-155在不同临床病理特征中的表达比较 观察组miR-21的表达为283.21～542.12，平均402.11±56.17；miR-155的表达为302.31～596.31，平均456.31±56.21。miR-21和miR-155在不同组织学分级、脉管癌栓及有无坏死、钙化的分组中的表达差异有统计学意义，表3，图1，图2。

图1 miR-21在乳腺癌中的表达

图2 miR-155在乳腺癌中的表达

表3 观察组中miR-21和miR15在不同临床病理特征中的表达比较

2.4 观察组5年内是否复发患者miR-21和miR-155表达的比较 观察组5年内复发患者miR-21和miR-155的表达明显高于非复发患者，表4。

表4 观察组5年内是否复发患者miR-21和miR-155表达的比较

2.5 观察组中miR-21和miR-155表达的生存分析 对患者均进行术后5年(60个月)生存时间的随访，随访的末次时间是2019年4月4日，患者术后生存时间为10～60个月。生存分析显示miR-21(临界值为283.21，χ2=4.24，P=0.023)和miR-155(临界值为302.31，χ2=5.09，P=0.016)与生存时间有关，即miR-21和miR-155高表达患者的生存时间短，预后差(图3、图4，表5)。

图3 miR-21的表达与生存时间的关系

图4 miR-155的表达与生存时间的关系

表5 COX回归模型对患者影响的单因素生存分析结果

3 讨论

乳腺癌改良根治手术是治疗的常用方法，但是手术时切除的范围大，常有局部体形的改变，患者心理及生活质量受到影响[4]。保乳治疗是近年应用于早期乳腺癌的治疗方法，主要针对无淋巴结转移的患者，术中冰冻检测前哨淋巴结是重要的方法[5]。本研究结果显示保乳手术与改良根治术治疗后的3年和5年随访生存率无明显差别，提示两种治疗均可以应用于临床中。结果显示观察组随访生活质量评分明显高于对照组，提示保乳手术可以改善患者的生活质量。针对预后相关影响因素，本研究检测了观察组中miR-21和miR-155的表达，结果显示两者均与组织学分级、脉管癌栓、有无坏死及钙化有关，以上因素均与乳腺癌的生物学行为及预后有关，因此两者高表达提示肿瘤处于进展状态。本研究发现miR-21和miR-155的表达与患者术后复发有关，且两者的表达与生存时间有关，因此两者高表达的状态常提示肿瘤易于复发及不良的预后，临床检测miR21和miR-155有重要意义。保乳手术常与术后的化疗、放疗及内科治疗同时进行，临床应用前景广泛。保乳手术在手术时的范围要足够，一般为肿瘤边缘周围的2～2.5 cm，术中冰冻对判断切缘的状态有重要意义，依靠术中病理将肿瘤完整切除。近年来学者认识到非编码RNA的重要作用，认为其在肿瘤的发生、发展过程中及预后判断中具有一定的调节作用[6]。非小细胞肺癌中miR-155的高表达表现为明显的促进作用[7]。非翻译区出现了miRNA，是miR-21的有效识别位点，并且可以和miR-661进行靶定位点结合，同时能够对其它的miRNA进行调控[9]。也有研究认为miRNA能够对转录后水平的基因翻译过程进行抑制，进而对靶miRNA进行调解，使靶基因的生物学功能发生改变。miR-21和miR-155的异常表达参与肿瘤细胞的失控性增生和异常增殖，肿瘤细胞数量增加，肿瘤体积增大。miR-21和miR-155的表达变化对细胞增殖的作用可能更直接[10]。miR-155的作用与癌基因相似，其活化后的作用与整合素的激活有关，引起肿瘤细胞迁移的能力增强。异常表达的miR-155可以表现为对导管上皮-间质转化的诱导作用，可能与对核因子等相关癌基因的调控有关[11-12]。保乳手术的重点为监测术后复发情况，多种指标虽然可以辅助判断，但是其特异性较差[13-14]。本研究发现的检测miR-21和miR-155的表达与生存时间的关系可能为临床判断肿瘤的预后提供一种新的客观指标，同时也为临床术后复发的判断提供了指标，联合其它实验室指标可能对指导临床工作具有一定价值[13-15]。

miR-21和miR-155的明显升高可作为乳腺癌的危险因素，同时患者采用保乳手术进行治疗，无论治疗效果还是生活质量都明显升高。而术后监测miR-21和miR-155的表达对判断预后同样具有一定价值。