4种自身抗体对类风湿性关节炎的诊断价值比较

王利民 巩瑞 吴俊琪

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种病因不明、以慢性炎性滑膜炎为主的系统性自身免疫性疾病，其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，常伴有肺部、肾脏、心血管系统等关节外表现及伴发其他自身免疫病的重叠综合征。RA可发生于所有年龄段，男女比例1∶4[1]。2010年美国风湿病协会提出的RA分类标准，把抗瓜氨酸蛋白抗体（ACPAs）列入血清学检测指标。与类风湿因子（RF）相比，抗环瓜氨酸多肽抗体（CCP）诊断RA灵敏度和特异度更高，已被临床广泛应用。而关于抗核周因子抗体（APF）诊断RA价值的研究，目前多集中于诊断的灵敏度和特异度以及与疾病活动性的关系。本研究比较了抗APF、抗角蛋白抗体（AKA）、抗CCP、RF在RA患者中阳性率的差异，探讨上述自身抗体在RA诊断中的价值以及抗APF与RA病程、关节外表现和重叠综合征的相关性，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2019年3至12月浙江大学医学院附属金华医院就诊的RA患者257例，男51例，女206例，年龄 11～85（58.22±11.61）岁；病程 0.1～40 年，中位病程 8（3，15）年；平均 28 关节疾病活动性指数（DAS28）为 3.52±1.18；中位 CRP 水平为 9.4（1.25，23.60）mg/L；平均骨密度（BMD）为-1.68±1.16；均符合美国风湿病学会（American College of Rheumatology,ACR）1987年推荐的RA分类诊断标准[2]。非RA自身免疫患者217例，男 72例，女 145例，平均年龄（46.24±13.38）岁，包括系统性红斑狼疮（rheumatoid arthritis,SLE）42例，强直性脊柱炎（ankylosing spondylitis,AS）89例，干燥综合征（Sjogren's syndrome,SS）72例，系统性硬化症（systemic sclerosis,SSc）14例，诊断均符合相应的国际分类诊断标准[3-6]；选取同期本院健康体检中心的健康体检者40例，男 18例，女 22例，平均年龄（39.50±14.19）岁。3组间性别、年龄比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 试剂 抗角蛋白抗体（AKA）间接免疫荧光法检测试剂盒（德国欧蒙医学实验诊断股份公司）；抗APF间接免疫荧光法检测试剂盒（北京和杰创新生物医学科技有限公司）；抗CCP化学发光法检测试剂盒和仪器i-Flash 3000（深圳亚辉龙生物科技股份有限公司）；RF速率散射比浊法检测试剂盒和仪器西门子BNⅡ（德国西门子生物科技有限公司）。

1.3 方法 采集清晨空腹静脉血4 ml，室温凝集1 h后，4℃1 500 g离心5 min分离血清，将血清分装并冻存于-80℃备用。

1.3.1 抗AKA检测 采用间接免疫荧光法（IIF）检测。血清1∶10稀释后，加25 μl稀释血清至抗原基质片反应区，室温孵育反应30 min，洗涤液冲洗后在PBS缓冲液中浸泡5 min，加入20 μl FITC标记的抗人球蛋白，避光室温孵育30 min，流水冲洗在PBS缓冲液中浸泡5 min，滴加甘油介质至盖玻片，封片后在荧光显微镜下观察结果。抗体滴度＞1∶10为阳性。

1.3.2 抗APF检测 采用IIF检测。血清1∶20稀释后，加25 μl稀释血清至抗原基质片反应区，室温孵育反应30 min，洗涤液冲洗后在PBS缓冲液中浸泡5 min，加入25 μl FITC标记的兔抗人球蛋白，避光室温孵育30 min，洗涤液冲洗后在PBS缓冲液中浸泡5 min，滴加甘油介质至盖玻片，封片后在荧光显微镜下观察结果。同一反应孔阳性细胞＞5个为抗APF阳性，＜5个为可疑，少于2个为阴性。

1.3.3 抗CCP和RF检测 采用化学发光法检测抗CCP，抗 CCP＞5.0 U/ml为阳性，线性范围 0.5～200 U/ml，＞200 U/ml按200 U/ml计算。采用速率散射比浊法检测 RF，RF＞15.0 U/ml为阳性。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）表示。抗APF、抗AKA、抗CCP和RF阳性率的比较采用χ2检验；抗APF与晨僵、病程、CRP、BMD、DAS28的相关性分析采用Spearman秩相关；抗体诊断价值采用ROC曲线分析，以约登指数最大值确定最佳临界值，获得AUC、灵敏度、特异度。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 257例RA患者4种自身抗体阳性率的比较 抗APF的阳性率高于抗AKA，差异有统计学意义（P＜0.05），低于抗CCP和RF的阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 257例RA患者4种自身抗体阳性率的比较[例（%）]

2.2 4种自身抗体在RA中的诊断价值 以确诊RA为阳性病例，以非RA组和健康体检者为阴性病例，使用ROC曲线，AUC值，灵敏度、特异度评价抗APF、抗CCP、RF和抗AKA对RA的诊断价值。在最佳临界值时，抗APF诊断灵敏度为87.2%高于抗CCP抗体的81.3%，差异有统计学意义（P＜0.05），高于RF的85.6%差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1和表3。

图1 4种自身抗体诊断类风湿关节炎（RA）的ROC曲线

表3 抗APF，抗CCP，RF和抗AKA对RA的诊断效能

2.3 抗 APF 与晨僵、RA 的病程、CRP、BMD、DAS28、抗CCP、抗AKA、RF之间的相关性 平均抗APF为（4.67±2.35）个/孔，抗 CCP 为（102.18±84.72）U/ml，抗 AKA 稀释倍数为 1：16.94±7.44，RF 为 84.6（25.1,345.5）U/ml；抗APF阳性患者中有晨僵85例，无晨僵25例，阴性患者中有晨僵96例，无晨僵51例；抗APF与RA病程、抗AKA、有无晨僵均呈正相关（均 P＜0.05），与 CRP、抗CCP、RF均呈负相关（均 P＜0.05），与 BMD 和 DAS28不相关（均 P＞0.05），见表 4。

表4 抗APF与RA病程、抗CRP、BMD、DAS28之间的相关性

2.4 4种自身抗体与关节外表现和重叠综合征之间的关系 257例RA患者中，有16例（6.23%）同时伴发有其他自身免疫性疾病（包括SS 7例，结缔组织病3例，系统性红斑狼疮2例，自身免疫性肝病3例，多发性肌炎1例）的重叠综合征，156例（60.7%）伴有关节外表现，其中肺部受累42例（16.34%），血液系统受累100例（38.91%），肾脏受累 4例（1.56%）。抗 APF、抗 CCP、抗AKA和RF与重叠综合征无统计学差异（χ2=0.006、0.023、0.299、0.072，均 P＞0.05）；抗 APF和抗 CCP与关节外表现差异有统计学意义（χ2=6.972、9.245，均 P＜0.05），抗AKA、RF与关节外表现差异无统计学意义（χ2=3.601、0.024，均 P＞0.05）。见表 5。

表5 4种自身抗体与关节外表现和重叠综合征之间的关系（例）

3 讨论

RA是系统性自身免疫病中常见的一类疾病，目前大部分实验室对ACPA家族中抗CCP和RF应用较多，然而仍有很大一部分疑诊人群RF和抗CCP均为阴性，抗APF的检测可以补充RA血清学诊断的不足，本研究对RA患者分析证实了抗APF在疾病诊断中的应用价值。抗APF在257例RA中的阳性率为42.80%，低于RF和抗CCP，差异有统计学意义（P＜0.05），与Cassani等[7]报道抗APF在90例RA患者中阳性率为82%不一致，可能为人种或者选取患者有关。与孙佳颖等[8]报道的抗APF在196例RA患者中的阳性率44.39%相近。4项联合抗APF/抗CCP/RF/抗AKA和3项联合抗APF/抗CCP/RF的阳性率均为94.16%，高于抗CCP的79.77%，差异有统计学意义（P＜0.05），与孙佳颖等[8]报道一致。本研究发现抗APF最佳临界值为2.5时，诊断灵敏度（87%）高于抗 CCP和 RF，特异度低于抗CCP，与Cassani等[7]报道抗APF在90例RA患者中灵敏度为82%一致，ROC曲线计算值与说明书给定的阈值不同情况，可能因素为单中心研究人群的选择性偏移等造成。

Gonzalez-Lopez等[9]报道235例RA患者（有关节外表现95例，无关节外表现130例），患者年龄高、长病程、高DAS28评分与关节外表现相关，抗CCP、RF与关节外表现无相关性，本研究发现抗APF和抗CCP与RA关节外表现有统计学差异，RF和抗AKA与关节外表现差异无统计学意义，与Gonzalez得出的结论不同。有关RA重叠综合征相关文献报道多为个案报道，其中最多见的是Rhupus综合征、RA合并SS或RA合并SSc等[10-12]。本研究发现抗APF、抗CCP、RF和抗AKA与RA重叠综合征差异无统计学意义；APF与RA的疾病活动度不相关，与Abedian Zeinab等[13]报道不一致。本研究还发现抗APF与RA的活动指标CRP呈负相关，而与DAS28不相关，有待进一步研究。

综上所述，本研究通过分析4种自身抗体在RA诊断中的应用价值，分析抗APF抗体与病情进展的关系，发现抗APF在RA诊断有更高的灵敏度，抗APF和抗CCP与关节外器官受累有关，发现抗APF与RA病程和晨僵均呈正相关。但本研究为回顾性单中心研究，有可能存在选择性偏移。