大鲵血液中免疫球蛋白免疫活性研究

董梦尧， 陈德经,2*， 贺屹潮， 曾允灏， 胡双宏

(1.陕西理工大学 生物科学与工程学院，陕西 汉中 723000；2.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室，陕西 汉中723000)

大鲵(Andriasdavidianus)属两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科，是世界现有两栖类古老动物中寿命最长、体型最长的动物，有“活化石”的美誉，至今已有3亿多年演化史[1]。大鲵浑身是宝，黄世英等[2]发现大鲵肉中蛋白质含量高，人体必需的氨基酸、鲜味氨基酸含量丰富，营养价值高。大鲵黏液中富含糖蛋白、胶原蛋白等多种蛋白质，抗氧化、抗肿瘤性好，可制作疤痕贴；大鲵骨粉中富含钙及硫酸软骨素，用于治疗关节炎以及骨质疏松的药品开发有很好的前景。动物血液中富含红细胞、血小板、血红蛋白等，是体液免疫的重要组成部分，制成食品可以补充人体所需的多种微量元素及铁质。而目前在宰杀大鲵时，其血液直接流失未加以利用，是一种严重的资源损失。

免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)为一类具有抗体活性(或化学结构)与抗体相似的球蛋白，是构成体液免疫作用的主要物质，可增强机体的防御能力。有关动物血液中免疫球蛋白的研究逐渐广泛。胡晓艳[3]以新鲜猪血浆为原料，利用饱和硫酸铵盐析法提取免疫球蛋白得到IgG含量可达88.08%，且IgG无毒并在一定剂量时可不同程度增强小白鼠体液免疫能力；庄甜甜[4]通过新型混合模式吸附层的方法对猪血中免疫球蛋白进行分离纯化，得到免疫球蛋白纯度达71.4%以上；李廷军[5]和刘爱国[6]等采用饱和硫酸铵盐析法和低温乙醇法，对牦牛血清中免疫球蛋白进行分离提取，得到最优工艺条件；于海燕等[7]进一步研究了牦牛血清中免疫球蛋白热稳定性及热变性动力学；胡刚[8]确定了酶解免疫球蛋白的最佳工艺脱色参数，得出免疫球蛋白对仔猪体重有明显增加的影响；银雪[9]对牛乳中的免疫球蛋白作了提取检测；游敬刚等[10]综述了猪血中血浆蛋白的生理活性及制备方法；张效荣等[11]对猪血免疫球蛋白提取条件进行了优化，得出pH呈中性，加硫酸铵盐析提取免疫球蛋白纯度最高。鱼类血液中也富含多种免疫球蛋白(Ig)，大多为IgM，软骨鱼类中有少见的IgNAR、IgNARC和IgX等[12-13]。林娟娟等[14]应用亲和层析技术对欧洲鳗免疫球蛋白作纯化，兔抗血清对得到的Ig有抗原特异性。许娜娜等[15]采用硫酸铵分级沉淀法提取的花鲈Ig为具有79 kDa重链和29 kDa轻链的免疫球蛋白。对于大鲵血液的研究仅有王芳[16]对患虹彩病毒病大鲵和健康大鲵的血液生理生化指标进行了比较分析，并以大鲵虹彩病毒细胞培养灭活疫苗为免疫原，做免疫大鲵攻毒试验。而对大鲵血液中免疫球蛋白的研究却未见相关报道。

动物血液中免疫球蛋白的研究层面越来越广，鱼类、哺乳动物类均有涉及，大鲵作为两栖类动物，血液开发有极好的前景和意义。目前为了保护大鲵血液资源，加大对大鲵血液的开发利用力度，在宰杀大鲵时收集其新鲜血液，测定血液的常规指标，并对加入抗凝剂后得到的血清进行脱色脱腥处理，为后续制备蛋白粉作技术支撑，同时参照张效荣等[11]对猪血液中免疫球蛋白的提取方法——硫酸胺盐析、透析袋纯化提取免疫球蛋白，采用SDS-PAGE方法测定其蛋白分子量，通过小鼠灌胃实验，对比实验组与空白组、环磷酰胺组的体重差异、脾脏指数、胸腺指数差异，判断巨噬细胞功能及免疫因子活性作用，探讨免疫球蛋白的免疫活性，为大鲵血的高值化加工与利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验材料：大鲵新鲜血液由陕西省资源生物重点实验室大鲵养殖室提供(所选3只大鲵均为5～6年生，生长状态良好，无疾病，体重3.8～4.0 kg，体长70～80 cm)；SPF级昆明种小鼠购自西安交通大学医学院实验动物中心。

主要试剂：环磷酰胺购自众化(杭州)科技有限公司，氯化钠(分析纯)、活性炭、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、30%过氧化氢(分析纯)、均购自天津市盛奥化学试剂有限公司，免疫因子检测试剂盒(IL-6、IFN-γ、TNF-α)购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1750型紫外可见分光光度计，日本岛津仪器公司；DYCZ-24DN垂直电泳仪，北京六一生物科技有限公司；LGJ-40E型真空冷冻干燥机，北京四环科学仪器厂有限公司；酶标仪，江苏普昀生物技术有限公司；SYSMEXSF-3000全自动五分类血球计数仪，日本东亚公司。

1.3 方法

1.3.1 大鲵血液常规检验

采集宰杀空腹1天的大鲵新鲜血液，取2 mL注入EDTA-K2抗凝管，立刻将采血管缓慢地颠倒混匀10次，以防凝固，待15 min后进行测定。使用血球计数仪检测血液，观察并记录WBC白细胞、RBC红细胞、血红蛋白、血小板、尿酸及血糖等各项指标[17-18]。

1.3.2 大鲵血清液的制备

宰杀大鲵时收集大鲵血液，按大鲵血液质量与抗凝剂体积的比值为0.5%加入抗凝剂，与大鲵血液混合，搅拌，充分溶解。将血液置于4000 r/min下离心10 min，取上层血清，储藏于4 ℃冰箱备用[11]。

1.3.3 免疫球蛋白提取工艺

参照文献[11]对猪血中免疫球蛋白提取方式，确定最佳硫酸铵饱和度，提取工艺如下：

血清溶液→1∶1溶于pH 7 PBS溶液→45%硫酸铵饱和→40 ℃静置→

高速离心→透析→真空干燥→免疫球蛋白粉末

免疫球蛋白提取率计算公式为

W=m/V，

式中W为提取率(mg/mL)，m为提取得到免疫球蛋白质量(mg)，V为提取前血清液体积(mL)。

1.3.4 分子量的测定

取新鲜大鲵血清液、冻干后免疫球蛋白，按1∶1加入上样缓冲液，按照聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，与标品marker进行对照，即得免疫球蛋白的分子量范围。

1.3.5 动物免疫实验

环磷酰胺具有降低免疫力的作用，进入人体内被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，在医疗上常用作细胞毒性药物。免疫毒理学研究时，常将环磷酰胺作为细胞免疫、体液免疫和巨噬细胞测定时的对照物[19]。

取6～8周龄雄鼠，按体重随机分为3组，每组8只，体重每周称量一次，在平均体重达27 g时进行实验。

正常对照组：每只小鼠灌胃1 mL的0.9%生理盐水。

环磷酰胺组：实验开始前5 d连续对小鼠每天灌胃80 mg/kg bw(20 mg/mL)1 mL的环磷酰胺，第6天开始同体积每天灌胃生理盐水至最终。

免疫球蛋白：实验开始前5 d连续对每天灌胃80 mg/kg bw(20 mg/mL)1 mL的环磷酰胺，第6天开始按250 mg/kg bw(2.5 mg/mL)每天灌胃同体积免疫球蛋白(以生理盐水溶解)至最终。

1.3.5.1 小鼠免疫脏器指数测定

胸腺与脾脏为动物免疫机能的主要承载者，分别测定其重量，能够显著反映出免疫机能的变换。当胸腺和脾脏发生细微的形态变化时，其相对重量改变可作为形态学指标的一项敏感参数。将体重达30 g并且灌胃30 d天的小鼠，于停药次日称重处死，再取胸腺和脾脏称重，按下式计算脏器指数：

式中W1为胸腺指数(mg/g)，m1为胸腺质量(mg)，m0为小鼠质量(g)，W2为脾脏指数(mg/g)，m2为脾脏质量(mg)。

1.3.5.2 小鼠腹腔巨噬细胞功能影响

在所有实验小鼠结束给予受试物后，给每一只小鼠的腹腔注射体积分数1%的鸡红细胞(CRBC)0.5 mL。在注射CRBC后1～12 h内，采用颈椎脱臼法处死小鼠，并对小鼠腹腔注射生理盐水2 mL，轻揉腹部10 min后，剪开腹腔皮肤，用注射器吸取腹腔液少许，涂片，于室温下晾干后用与腹腔液体积比1∶1的丙酮甲醛混合液固定，晾干后采用吉姆萨(Giemsa)染色，30 min后使用蒸馏水漂洗吹干。于油镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞现象[19-22]。在油镜下随机计数100个巨噬细胞中可吞噬CRBC的巨噬细胞个数，为吞噬率；被吞噬的CRBC细胞总数占总共计数的巨噬细胞的数量，即吞噬指数[19]，按下式计算：

式中W3为吞噬率(%)，n1为100个巨噬细胞中吞噬CRBC的细胞个数，n2为被吞噬的鸡红细胞总数，n3为计数的巨噬细胞数。

1.3.5.3 免疫因子测定

将采集的实验小鼠血浆严格按照小鼠白细胞介素6(IL-6)、γ干扰素(IFN-γ)、α(TNF-α)试剂盒的说明书进行详细检测。

1.3.6 数据处理

利用SPSS 25软件进行数据显著性分析，数据为3次重复所得，基础数据采用M±SD表示。

2 结果与分析

2.1 大鲵血液常规检测结果

目前未见对大鲵同属类动物血液研究的相关报道，因此根据现有研究现状，将大鲵血液的血液常规检测值与正常人、乌鸡[23]、牛蛙[24]、乌龟[25]的相关指标作简单比较，结果见表1。

表1结果说明，大鲵血液中白细胞数高于人体，低于乌鸡，与乌龟血液中的含量相接近，表明其吞噬病菌的能力优于人体次于乌鸡，与乌龟相当。其红细胞数少于乌龟、乌鸡，血红蛋白含量与牛蛙、乌龟的接近，表明两栖类动物耗氧量低。大鲵的尿酸值大约只有乌龟与乌鸡的1/3，大鲵血、乌鸡的血糖偏高，乌龟的血糖偏低。

2.2 大鲵血免疫球蛋白提取率

从大鲵血清液中提取的免疫球蛋白经真空冷冻干燥成白色粉末，免疫球蛋白的提取率(占全血的比例)为5.8 mg/mL，比牦牛血清、猪血清的提取率低(牦牛血清为9.205 mg/mL，猪血清为11.5 mg/mL)[4-5]，比鹅血清提取率高(鹅血清为0.681 mg/mL)[26]。

2.3 大鲵血免疫球蛋白分子量

分别对大鲵血清、免疫球蛋白作SDS-PAGE凝胶电泳，结果如图1所示。

1.大鲵血清；2.大鲵血液中提取的免疫球蛋白

由图1可知，大鲵血清中蛋白种类很多，浓度大，范围约为22～245 kDa，经过硫酸铵提取、透析后得到的免疫球蛋白，在65 kDa、70 kDa周围有两条重链，40 kDa有一条轻链，总分子量约为175 kDa，位于Ig A与IgD之间。鹅血中纯化后的免疫球蛋白有两条泳带，分别为57 kDa、25 kDa，与IgG的H链、L链的分子量(55 kDa、24 kDa)相吻合，确定为IgG[26]，猪血中免疫球蛋白分子量为50 kDa、25 kDa[8]，大鲵血由于属于两栖动物，其免疫球蛋白重链与鹅血、猪血重链相差小，轻链与鱼类相接近。

2.4 免疫作用结果

2.4.1 免疫球蛋白对小鼠体重的影响

实验动物在经灌胃后，具有明显毒性的药物会破坏小鼠的免疫系统，影响导致小鼠体重显著降低。因此，本实验对空白组、免疫球蛋白组、环磷酰胺组的体重变化趋势作了统计分析，如表2所示。

表2 免疫球蛋白组对小鼠体重的影响

由表2中的数据可知，与环磷酰胺对照组相比，免疫球蛋白组的小鼠各阶段体重增加有显著性差异(P<0.05)，且实验过程中，免疫球蛋白组在灌胃阶段无小鼠死亡，不具有显著毒性，同时体重比较说明在被机体吸收后对机体的生理性无法通过体重反映。免疫球蛋白对小鼠的体重没有影响。

2.4.2 小鼠免疫脏器指数

脾脏是动物的外周免疫器官，能够显著地反映机体细胞免疫与体液免疫的免疫效果。灌胃小鼠后检测脾脏指数结果如表3所示。

表3 免疫球蛋白对免疫低下小鼠脏器指数的影响

由表3的数据分析可以得出，与空白组相比，环磷酰胺组小鼠的胸腺和脾脏明显萎缩变小，其次占据小鼠体重比例也与正常小鼠差异显著(P<0.05)。而免疫球蛋白组的小鼠脾脏指数与空白组比较，差异不显著，与环磷酰胺组比较，差异极其显著(P<0.01)，胸腺指数与环磷酰胺组、空白组比较，均显著(P<0.05，P<0.01)，则免疫球蛋白对免疫低下的小鼠有减缓环磷酰胺对小鼠脏器伤害的效果。

2.4.3 小鼠腹腔巨噬细胞功能

巨噬细胞属于免疫细胞的一种，可参与非特异性防卫(先天性免疫)和特异性免疫(细胞免疫)，是细胞免疫学的重要研究对象。本实验中对免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬活性见表4。

表4 免疫球蛋白对免疫低下小鼠的腹腔巨噬细胞功能影响

环磷酰胺组的小鼠相对于空白组，吞噬能力显著降低(P<0.05)，而免疫球蛋白组的小鼠，对比空白组，吞噬能力有所降低，但是相比较环磷酰胺组，吞噬指数没有显著变化(P>0.05)，吞噬率有所增加(P<0.05)，免疫球蛋白对小鼠的吞噬细胞能力不具明显的影响。

2.4.4 免疫因子测定结果

TNF-α、IL-6和IFN-γ在血清中含量的变化，是评价给试物对小鼠免疫系统调节作用的重要指标。

由表5可得，对照环磷酰胺组与空白组发现，IL-6免疫因子的含量明显降低(P<0.05)，IFN-γ、TNF-α相对有所降低，但差异不显著。免疫蛋白组对照空白组、环磷酰胺组，免疫因子IL-6有所增加，且IL-6的含量与环磷酰胺组比较，亦增加显著(P<0.05)。由此可知，免疫球蛋白对于小鼠血清中细胞因子IL-6有明显的促生作用。

表5 免疫球蛋白对免疫低下小鼠分泌IL-6、IFN-γ、TNF-α能力的影响

3 结论

大鲵血液中不仅白细胞、血红蛋白含量与牛蛙和乌龟的相接近，与乌鸡血清生化指标有明显差异，而且具有丰富的免疫球蛋白，总蛋白分子量约为175 kDa。65 kDa、70 kDa周围有两条重链，40 kDa有一条轻链，与猪血、鱼类血液蛋白分子量存在差异。大鲵血液中的免疫球蛋白对实验小鼠免疫活性(免疫因子IL-6)提高具有显著作用。

后续研究对大鲵血液免疫球蛋白提取工艺进行优化，可制成蛋白粉类制剂，为大鲵血液保健品的研发提供基础，为大鲵血副产物的高值化利用开辟新途径。