mNGS技术在儿童重症肺炎病原学诊断中的价值

黄珮琪 陆小霞 陈和斌 杜慧 李颖 陈红卫

社区获得性肺炎（community acquired pneumonia，CAP）是儿童期常见感染性疾病，也是5 岁以下儿童死亡的首位病因［1］。由于小儿肺功能发育不完全、抵抗力较弱，7%～13%肺炎可发展为重症肺炎，给家庭带来沉重负担［2-3］。目前常用检查方法有传统微生物培养、核酸扩增检测、分子免疫学检查等，但这些检测方法存在样本处理过程复杂、花费时间长、病原体检测种类少等缺点［4］。宏基因组二代测序（Metagenomic next generation sequencing，mNGS）是一种不依赖于分离培养的新兴病原体检测技术［5］。以其不需培养、鉴定速度快、准确率高等优点逐步应用于感染性疾病领域［6］。本研究对219 例社区获得性重症肺炎患儿的病原学mNGS 资料进行分析，旨在为临床诊断提供理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年12月至2020年6月武汉儿童医院收治住院治疗的219 例社区获得性重症肺炎患儿临床资料。纳入标准：①所有患儿均参照中华医学会儿科学分会呼学组制定的《儿童社区获得性肺炎管理指南（2013 版）》［7］。②患儿均有行支气管镜术的适应症［8］，并与家长签署支气管镜检查的知情同意书，且家长同意行mNGS 检查。③临床资料完整。排除标准：①因其他原因入院，院内发展为重症肺炎；②合并其他免疫缺陷疾病。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

所有患儿入院当天采样，完善血常规、CRP、PCT、（1，3）-β-D 葡聚糖检测（G 试验）、半乳甘露聚糖检测（GM 试验）、肺炎支原体抗体等检查。219 例患儿均进行支气管镜检查，采集其肺泡灌洗液并分为两份，一份送检一般细菌涂片及培养，另一份送检mNGS，标本转运符合规范要求。

1.3 设备与检测方法

采取合格样本，送至华大基因测序仪平台（深圳华大基因股份有限公司，型号：BGISEQ-50）进行检测，经DNA 提取、文库构建和测序，测序数据下机后去除低质量和长度小于35 bp 的数据以获得高质量的数据。通过BWA（BWA：http：//bio-bwa.sourceforge.net/）比对将高质量数据中比对上人参考基因组序列的数据去除。剩下的数据在去除低复杂度reads 后与专用4 个微生物大数据库比对，获得能够匹配到某种病原体的序列数，根据序列数的高低以及临床其它检测来判断可能的病原体。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0 统计学分析；计量资料以（±s）表示，两组间采用t检验；计数资料以n（%）表示，行χ2检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mNGS 与传统实验室病原检出分析

2.1.1 病原检出情况

219 例送检标本中mNGS 共检出阳性病例190例（86.76%）；而传统实验室病原共检出阳性病例173 例（78.99%），两种检测方法比较，差异有统计学意义（χ2=4.649，P＜0.05）。见表1。

2.1.2 年龄分布

mNGS 和传统实验室病原病原总检出率在各年龄段之间比较，差异有统计学意义（χ2=76.488 7，P＜0.05）。见图1。

2.2 肺泡灌洗液mNGS 与传统实验室病原诊断儿童重症肺炎病原学诊断结果

mNGS 与传统实验室病原学检测均阳性患者163 例，mNGS 与传统实验室病原学检测均阴性患者22 例，mNGS 阳性而传统实验室病原学检测阴性患者27 例，mNGS 阴性而传统实验室病原学检测阳性患者7 例。

2.3 肺泡灌洗液mNGS 与传统实验室病原诊断儿童重症肺炎病原学灵敏度、特异度

mNGS 与传统实验室病原诊断儿童重症肺炎病原学灵敏度、特异度比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

现临床对于微生物分离培养技术依赖病原体活力；但由于病灶受纤维组织包围影响及抗生素的应用，阳性培养率较低，无法满足快速、准确诊断感染需求［7-8］。mNGS 是临床中新推出的病原学检测方式，其只需提取患儿少量DNA 即可快速检测鉴定病

表1 不同年龄组患儿二代测序及传统实验室病原检出情况及病原体类型［n（%）］Table 1 Second generation sequencing and traditional laboratory pathogen detection and pathogen types in children of different age groups［n（%）］

续表1Continued Table 1

图1 不同年龄段患儿病原检出情况Figure 1 Detection of pathogens in children of different ages

表2 肺泡灌洗液mNGS 与传统实验室病原诊断儿童重症肺炎病原学灵敏度、特异度（%）Table 2 sensitivity and specificity of alveolar lavage fluid（BALF）mngs and traditional laboratory pathogens in the diagnosis of severe pneumonia in children（%）

原体；具有其通量高、敏感性高、无偏倚等优势。本研究显示，采用mNGS 检测重症肺炎病原检出率达86.76%，略高于上海［9］、南京［10］等地的报道。且病原检出以病毒检出率最高，其次为细菌、肺炎支原体、真菌等。与房亚菲等［11］收集了586 例社区获得性肺炎患儿的病原学资料检出病原结构相似。

而病毒病原学诊断中，mNGS 共检出病毒阳性者149 例，其中135 例腺病毒7 型阳性。孙永烽等［12］分析了2016 至2017年198 例重症肺炎患儿病原学特点，结果发现呼吸道合胞病毒最多见，腺病毒排第二，明显低于本研究结果。考虑腺病毒感染具有明显季节性，且与地域有关。本研究取样期间武汉市儿童呼吸道主要流行病原为腺病毒7 型，故样本中腺病毒7 型占主要比例。腺病毒7型作为腺病毒目前已知的100 多个基因型之一，具有组织嗜性广特点。其严重时可致多脏器功能障碍，诱发病死率高［13］。目前尚无针对腺病毒7 型感染后遗症的有效治疗方案。因此，对于重症腺病毒肺炎，早期使用mNGS 不仅有助于在病程早期阶段确诊病原，及时治疗，减少后遗症的产生。还可以判断是否有混合感染，避免不必要的抗生素使用，造成耐药的情况。

另本研究对比mNGS 以及传统实验室病原检测结果与传统ELISA 检查比较，mNGS 对于病毒的检测能够有效的克服前者缺陷，对于病毒抗体的检测达到精确性和及时性。郭玮等［14］对198 例重症肺炎患儿进行病原学分析，革兰阳性菌中，同样以肺炎链球菌及金黄色葡萄球菌为主。而革兰阴性菌中，则以鲍曼不动杆菌及肺炎克雷伯杆菌为主，流感嗜血杆菌仅排第四。本研究结果与之有部分差异，考虑可能与不同地区，不同季节气候，也可能与入院前抗生素的使用有关。故使用mNGS 能够更加精确地诊断重症肺炎，从而对临床的实际治疗进行科学的指导。但进行mNGS 检测时临床上缺乏标准化流程，且对检测者技术要求极高，因此检测医师应严格把握二代测序的适用条件，避免出现误诊。

综上所述，二代测序技术较传统实验室病原检测可快速检测重症肺炎患儿病原学诊断，指导临床早期合理用药。